بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای blaVIM و blaNDM در - دانلود رایگان
دانلود رایگان اسینتوباکتربومانی از پاتوژن های فرصت طلب در حال گسترش بوده، این باکتری یک باسیل گرم منفی، غیر متحرک، غیر تخمیری، پلی مورف، هوازی اجباری و معمولا کپسول دار
دانلود رایگان
| بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای blaVIM و blaNDM در اسینتوباکتربومانی های ایزوله شده از بیماران شهرتهرانعنوان صفحه چکیده 1 فصل اول - مقدمه 1-1- بیان مسأله 2 1-2- ضرورت انجام تحقیق 3 1-3-اهداف پژوهش 4 1-4-فرضیهها 4 1-5-تعریف متغیرها 4 فصل دوم – مروری بر تحقیقات انجام شده 2-1- تاریخچه جنس اسینتوباکتر بومانی 6 2-2- تاکسونومی رایج اسینتوباکتر بومانی 7 2-3- شناسایی گونه های اسینتوباکتر 7 2-4- جایگاه طبیعی اسینتوباکتر بومانی 8 2-5.فاکتورهای بیماری زایی اسینتوباکتر 8 2-6.منشا کلینیکی عفونت های اسینتوباکتر بومانی 10 2-6-1.مننژیت 10 2-6-2.عفونت خون 10 2-6-3.عفونت های دستگاه ادراری 10 2-6-4. پنومونی بیمارستانی 10 2-7. عفونت های بیمارستانی 11 2-8. استراتژی های درمانی عفونت های اسینتوباکتر بومانی 12 2-9. داروهای ضد میکروبی رایج 12 2-9-1. پلی میکسین ها 13 2-9-2.آمینوگلیکوزیدها 13 2-9-3.سولباکتام 14 2-9-4. کینولون ها 14 2-9-5.تتراسایکلین ها و تایگلیسین ها 15 2-9-6.آنتی بیوتیک های بتالاکتام 15 2-9-6-1.پنی سیلین ها 15 2-9-6-2.کارباپنم ها 17 2-9-6-3.سفالوسپورین ها 17 2-9-6-4. مونوباکتام ها 18 2-9-7.دیگر درمان های ترکیبی 18 2-10.مکانیسم عمل آنتی بیوتیک های بتالاکتام 18 2-10-1.پنی سیلین ها 18 2-10-2.کارباپنم ها 19 2-10-3.سفالوسپورین ها 19 2-11.مکانیسم های مقاومت 20 2-11-1.مکانیسم های مقاومت آنتی بیوتیکی 20 2-11-2.مکانیسم های مقاومت به بتالاکتام ها 21 2-11-2-1. مکانیسم های آنزیمی 21 2-11-2-2.مکانیسم های غیر آنزیمی 21 2-12.طبقه بندی بتالاکتامازها 22 2-13.بتالاکتامازهای باکتری های گرم منفی 24 2-14.بتالاکتامازهای باکتری های گرم مثبت 24 2-15.بتالاکتامازهای وسیع الطیف 24 2-16.خصوصیات آنتی بیوتیک های وسیع الطیف 25 2-17.حساسیت ESBL ها در مقابل آنتی بیوتیک ها 25 2-18.انواعESBL ها 26 2-18-1.بتالاکتامازهای تیپ SHV 26 2-18-2.بتالاکتامازهای تیپ TEM 26 2-18-3.بتالاکتامازهای تیپ OXA 27 2--18-4.بتالاکتامازهای تیپCTX-M 27 2-18-5. بتالاکتامازهای تیپ NDM(متالوبتالاکتاماز) 27 2-18-6.بتالاکتامازهای تیپ VIM(متالوبتالاکتاماز) 28 2-19. فاکتور هایی که بر بیان بتالاکتامازها اثر می گذارند 28 2-20.درمان عفونت های ایجاد شده توسط سویه های مولد ESBL 29 2-21.کنترل 30 2-22.مثال هایی از مکانیسم های مقاومت به بتالاکتام ها 30 2-22-1.مکانیسم مقاومت به کارباپنم ها 30 2-22-2.مکانیسم مقاومت به پنی سیلین ها 31 2-22-3.مکانیسم مقاومت به مونوباکتام ها 32 2-22-4.مقاومت به آمینوگلیکوزیدها 32 2-22-5. مقاومت به پلی میکسین ها 33 2-22-6.مقاومت به کینولون ها 33 2-22-7.مقاومت به تتراسایکلین ها و تایگلسین ها 33 2-23.مهارکنندگان بتالاکتامازها 34 2-23-1.مکانیسم عمل مهارکنندگان بتالاکتامازها 34 2-24.روش های شناسایی آنزیم های ESBL 35 2-24-1-1.آزمایش مجاورت دو دیسک 35 2-24-1-2.ترکیب دو دیسک 36 2-24-1-3.آزمایش سه بعدی 36 2-25.شیوع بیمارستانی و ارزیابی میزان کنترل 36 2-26.اپیدمیولوژی جهانی اسینتوباکتر بومانی 37 2-27. روش مولکولی دخیل در بررسی باکتری های مولد آنزیم های بتالاکتاماز وسیع الطیف 38 2-27-1. واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) 39 2-28.سوابق و پیشینه تحقیق 41 فصل سوم – مواد و روشها 3-1-وسایل موردنیاز 37 3-2-مواد موردنیاز 38 3-3-طریقه ساخت محیط های کشت 40 3-3-1.طرز تهیه محیط بلاد آگار(محیط پایه شرکت Merck ) 40 3-3-2. طرز تهیه محیط نوترینت آگار (شرکت Merck) 40 3-3-3. طرز تهیه محیط SIM(شرکت Merck ) 41 3-3-4. طرز تهیه محیط مک کانکی آگار(شرکت Merck ) 41 3-3-5. طرز تهیه محیط اوره براث(شرکت Merck ) 42 3-3-6. طرز تهیه محیط مولر هینتون آگار(شرکت Merck ):.................... 42 3-3-7. طرز تهیه محیط MRVP(شرکت Merck )................... 52 3-3-8. طرز تهیه محیط BHI براث(شرکت Merck) 52 3-3-9. طرز تهیه محیط TSI(شرکت Merck ): 53 3-3-10. طرز تهیه محیط سیمون سیترات (شرکت Merck ) 54 3-3-11. طرز تهیه محیط OF(شرکت Merck ):.......................................................................................... 54 3-4. روش انجام این پژوهش 55 3-4-1.جمع آوری نمونه 55 3-4-2.جداسازی باکتری ها 55 3-4-3. نگه داری باکتری ها در 80- درجه سلسیوس 57 3-5.آنتی بیوگرام 57 3-5-1-تهیه سوسپانسیون باکتریایی............................. 57 3-5-2-روش آنتی بیوگرام 58 3-6.استخراج ژنوم به روش جوشاندن 59 3-7. اندازه گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده 59 3-8. الکتروفورز محصول استخراج ژنوم 59 3-9.مواد و وسایل مورد نیاز برای اجرای PCR 59 3-9-1.DNA الگو 59 3-9-2.Master Mix 60 3-9-3.پرایمر 60 3-9-4.محلول کار پرایمر PCR 61 3-10.روش اجرا PCR 61 3-11.مواد و وسایل مورد نیاز برای اجرای الکتروفورز 63 3-11-1.بافرTBE 5X 63 3-11-2.بافر TBE 1X 63 3-11-3.ژل آگارز 5/1 درصد 63 3-12.روش انجام الکتروفورز 64 3-13.تعیین توالی 64 فصل چهارم – نتایج و بحث 4-1.جداسازی، کشت، تشخیص نمونه های باکتری 65 4-1-1. درصدو تعداد گونه های مختلف موجود در نمونه های جدا شده از بیماران 65 4-1-2. نتایج تست های افتراقی برای گونه های اسینتوباکتر بومانی 67 4-1-3. تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن 67 4-1-3-1.نتایج حاصل از روش دیسک دیفیوژن برای تمام ایزوله های اسینتوباکتر بومانی 67 4-1-3-2. تهیه الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی 69 4-2.استخراج DNA 72 4-3.نتایج بدست آمده در بررسی ژن کد کننده آنزیمblaVIM 73 4-4.نتایج بدست آمده در بررسی ژن کدکننده آنزیم blaNDM 74 4-5:.بحث 76 فصل پنجم – نتیجهگیری 5-1- نتیجهگیری 80 5-2-پیشنهادات 82 منابع 83 چکیده انگلیسی 94 فهرست جدولها عنوان صفحه جدول2-1:طبقه بندی بتالاکتامازها در باکتری های گرم منفی 23 جدول شماره 3-1: ترکیبات پایه ی محیط بلاد آگار 49 جدول شماره 3-2: ترکیبات محیط نوترینت آگار 49 جدول شماره 3-3: ترکیبات محیط SIM 50 جدول شماره 3-4: ترکیبات محیط مک کانکی آگار 50 جدول شماره 3-5: ترکیبات محیط اوره براث 51 جدول شماره 3-6: ترکیبات محیط مولر هینتون آگار 51 جدول شماره 3-7: ترکیبات محیط MRVP 52 جدول شماره 3-8: ترکیبات محیط BHI براث 52 جدول جدول شماره 3-9: ترکیبات محیط TSI 53 جدول جدول شماره 3-10: ترکیبات محیط سیمون سیترات 54 جدول شماره 3-11: ترکیبات محیط OF 55 جدول شماره 3-12:خلاصه نتایج حاصل از محیطOF 56 جدول شماره3-13:توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه 60 جدول شماره 3-14: محلول کاری پرایمر 61 جدول شماره3-15: ترکیب واکنش PCR برای هر نمونه 62 جدول شماره3-16: برنامه انجام واکنش PCR برای ژن VIM 62 جدول شماره 3-17 برنامه انجام واکنش PCR برای ژن NDM 62 جدول شماره3-18: طرز تهیه بافر TBE 5X 63 جدول شماره 4-1 : فراوانی اسینتوباکتر بومانی در نمونه کلینیکی مورد بررسی 66 جدول شماره 4-2: خصوصیات بیو شیمیایی اسینتوباکتر بومانی 67 جدول شماره 4-3: نتایج حساسیت اسینتوباکتر بومانی به دیسک های آنتی بیوتیکی در نمونه های کلینیکی مورد بررسی 68 جدول شماره 4-4 : الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در اسینتوباکتر بومانی 70 فهرست نمودارها عنوان صفحه نمودار شماره 4-1: فراوانی سویه های اسینتوباکتر در نمونه های کلینیکی مورد بررسی 66 نمودار شماره 4-2 : درصد مقاومت مشاهده شده در بین ایزوله های جدا شده از بیماران 69 نمودار شماره4-3: درصد فراوانی ژن های VIM,NDMمورد مطالعه در اسینتوباکتر بومانی های ایزوله شده از بیماران 75 فهرست شکلها عنوان صفحه شکل 4-1: بررسی کیفی .الکتروفورز نمونه هاي DNA استخراج شده با روش جوشاندن بر روي ژل آگارز 1 72 شکل 4-2: بررسی کمی. نتایج اندازه گیری غلظت DNA استخراجی با روش جوشاندن با دستگاه نانودراپ در طول موج 260 نانومتر 72 شکل شماره 4-3: الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلی فایل شده ی ژن blaVIM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR 73 شکل شماره 4-4 :الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلی فای شده ی ژن blaNDM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR چکیده: مقدمه : در حال حاضر بتالاکتام ها به عنوان داروی انتخابی در درمان عفونت های اسینتوباکتر بومانی مقاوم به چند دارو استفاده می گردد هرچند مقاومت به این عوامل رو به افزایش می باشد. این باکتری با مکانیسم های مختلف از جمله تولید بتالاکتامازها به این داروها مقاومت نشان می دهند. متالوبتالاکتاماز دارای تیپ های مختلفی می باشند که که در بین آنها blaVIM و blaNDMاز همه بارزتر است .با توجه به اینکه در شهر تهران میزان فراوانی ژن فوق در اسینتوباکتر بومانی مشخص نمی باشد این مطالعه با هدف بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای هایblaVIM و blaNDM در اسینتوباکتر بومانی های ایزوله شده از بیماران شهر تهران به روش مولکولی اجرا گردید. روش کار: این مطالعه برروی 500 نمونه بالینی جمع آوری شده از 3 بیمارستان شهر تهران طی مدت دو سال انجام گردید. پس از جمع آوری نمونه ها با استفاده از روش های کشت و بیوشیمیایی گونه اسینتوباکتر بومانی شناسائی گردید. سپس تست حساسیت آنتی بیوتیکی بر روی این ایزوله ها با روش دیسک دیفیوژن بر اساس دستور CLSI انجام گردید. در نهایت برای بررسی فراوانی ژن های blaVIM و blaNDM با استفاده از پرایمرهای اختصاصی PCR انجام شد. نتایج: با توجه به نتایج غربالگری اولیه، بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی در 100 ایزوله اسینتوباکتر بومانی مربوط به آنتی بیوتیک های سفی پیم و کمترین مقاومت مربوط به پلی میکسین B بدست آمد. نتایج PCR نشان داد که به ترتیب 17% و 20%، سویه ها حامل ژن های blaVIM و blaNDMمی باشند. بحث: این مطالعه نشان داد که ژنهای کدکننده blaVIM و blaNDMدر حال گسترش در بین سویه های بالینی اسینتوباکتر بومانی بوده، لذا شناسایی ژنهای فوق با استفاده از روش مولکولیPCR که روشی سریع و مقرون به صرفه است برای جلوگیری از انتشار عفونت در بیمارستان های شهر تهران پیشنهاد می شود. کلمات کلیدی: اسینتوباکتر بومانی، بتالاکتامازهای وسیع الطیف، دیسک ترکیبی، VIM، NDM، PCR صل اول مقدمه 1-1-بیان مسئله اسینتوباکتربومانی از پاتوژن های فرصت طلب در حال گسترش بوده، این باکتری یک باسیل گرم منفی، غیر متحرک، غیر تخمیری، پلی مورف، هوازی اجباری و معمولا کپسول دار است که بر روی محیط های معمولی آزمایشگاهی به آسانی رشد می کند . اندازه کلنی بین 1 تا 2 میلی متر، بدون پیگمان و صاف تا موکوئیدی است. در مرحله رشد لگاریتمی شکل باسیل دارند، ولی در مرحله سکون به صورت کوکوباسیل دیده می شوند اسینتوباکتر بومانی اکسیداز منفی هستند، توانایی احیای نیترات را ندارند، همچنین اندول منفی و کاتالاز مثبت می باشند. بر روی محیط آگار خون دار معمولا همولیز ایجاد می کنند و در دمای 44 درجه سلسیوس رشد می کنند. این باکتری ها در روی سطوح خشک تا مدت ها زنده باقی می مانند. مقاومت بالای این باکتری نسبت به شرایط محیطی (11روز در رطوبت نسبی 31 درصد، 4 روز در رطوبت نسبی 10 درصد) امکان حضور این باکتری را در محیط های بیمارستانی افزایش داده است. این ارگانیسم به عنوان فلور نرمال در پوست و دستگاه تنفسی افراد سالم وجود داشته و در سال های اخیر به عنوان یک عامل مهم در عفونت های بیمارستانی گزارش شده است. با وجود اینکه این باکتری معمولا از ویرولانس پائینی برخوردار است، اما می تواند طیف وسیعی از عفونت ها نظیر باکتریمی، سپتی سمی و پنومونی همچنین عفونت خون در بیماران دچار سوختگی با ضعف سیستم ایمنی را ایجاد نماید. اسینتوباکتر بومانی بیشترین عامل ایجاد کننده عفونتهای بیمارستانی به ویژه در بخش مراقبت های ویژه می باشند که نسبت به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها مقاومت نشان می دهند. اگرچه سویه های اسینتوباکتر بومانی معمولا در آب و خاک یافت می شوند، ولی منشا سویه های اپیدمیک مقاومت به چند دارویی آن از بیمارستان می باشد و این سویه ها از لحاظ ژنتیکی بسیار شبیه هم هستند. ریسک فاکتورهای مهم آن مصرف طولانی مدت آنتی بیوتیک، اقامت طولانی در بخش مراقبت های ویژه (ICU) و بیماری های جدی می باشد. اسینتوباکتر بومانی به عوامل ضد میکروبی بسیار مقاوم است که این مقاومت می تواند ذاتی و یا از طریق بدست آوردن عوامل ژنتیکی مقاومت باشد. درمان عفونت های اسینتوباکتر اغلب در مواردی که فنوتیپ مقاومت، چند دارویی است مشکل می باشد. این مقاومت ها اغلب با واسطه ژن هائی صورت می گیرد که بر روی عناصر ژنتیکی متحرک مثل ترانسپوزون ها و اینتگرون ها قرار داشته و به سادگی در میان باکتری ها انتشار می یابند. در حال حاضر بتالاکتام ها به عنوان داروی انتخابی در درمان عفونت های اسینتوباکتر بومانی مقاوم به چند دارو استفاده می گردد، هرچند مقاومت به این عوامل رو به افزایش می باشد. این باکتری با مکانیسم های مختلف به این داروها مقاومت نشان می دهند که می توان به موارد زیراشاره کرد. یکی از این عوامل ایجاد کننده مقاومت تولید متالوبتالاکتاماز می باشد. متالوبتالاکتامازها قادر به هيدروليز طيف وسيعی از بتالاکتام ها از جمله پنی سيلين ها، سفالوسپورين ها و کارباپنم ها هستند، اما توانايی هيدروليز مونوباکتام ها (آزترونام) را ندارند. متالوبتالاکتاماز بر اساس ساختار مولکولی به شش نوع تقسيم می شود که شامل ژنهای:AIM,NDM ,SPM ,SIM ,GIM ,IMP ,VIM هستند که در بين آنها VIM و NDM از همه بارزتر می باشد . 1-2.ضرورت اجرای تحقیق: شیوع وگسترش عفونت هاي بيمارستاني ازعلل شايع و مهم مرگ و مير، ناتواني، افزايش طول مدت بستري، تحميل وافزايش هزينه هاي بيمارستاني و بروزمشکلات بهداشتي مي باشند. اسينتوباكترهاي مقاوم به چنددارو مشكلات درماني دردنيا ايجاد نموده اند و دركشورايران نيزيك مشكل نوظهور مي باشند. در تحقیقات به عمل آمده به ویژه درایران ، به حضور blaVIM و blaNDM که منجر به نتایج منفی کاذب می گردند، کمتر اشاره شده است بنابراین ضروری است که برای شناسایی دقیق این نوع مقاومت از روش های مولکولی در کنار روش های فنوتیپی استفاده کنیم 1-3.اهداف پژوهش: تعیین میزان مقاومت داروئی و میزان شیوع ژنهای blaVIM و blaNDM در سویه های اسینتوباکتر بومانی ایزوله شده از بیماران شهر تهران در سال 1392 با روش مولکولی PCR. اهداف فرعی: تعیین الگوی مقاومت دارویی در ایزوله های جدا شده اسینتوباکتر بومانی با روش دیسک دیفیوژن شناسایی ژن مقاومتblaVIM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با روش PCR شناسایی ژن مقاومتblaNDM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با روش PCR 1-4.سوالات فرضیه: آیا ژن های کدکننده بتالاکتامازها در اسینتوباکتر بومانی وجود دارند و از طرفی اگر ژن های کد کننده بتالاکتامازها در اسینتوباکتر بومانی وجود دارند میزان شیوع آن ها چقدر است؟ 1-5.تعریف متغیرها: اسینتوباکتر بومانی: این باکتری پاتوژن فرصت طلب، کوکوباسیل، گرم منفی، هوازی اجباری، غیر تخمیر کننده، غیر متحرک، اکسیداز منفی، کاتالاز مثبت می باشد. بر پایه طبقه بندی جدید در خانواده Moraxelaceae در راسته Gammaproteobacteria قرار می گیرد. اسینتوباکتر بومانی که به بیش تر آنتی بیوتیک ها مقاوم می باشد سبب ایجاد عفونت ادراری، مننژیت، پنومونی و عامل اصلی عفونت بیمارستانی مخصوصا در بیماران بستری در بخش مراقبت های ویژه می باشد. بتالاکتامازهای وسیع الطیف: بتالاکتام ها دسته ای از آنتی بیوتیک ها(پنی سیلین، سفالوسپورین، مونوباکتام و کارباپنم) هستند که از سنتز دیواره سلولی با اتصال آنزیم های دخالت کننده در تولید پپتیدوگلیکان یعنی، پروتئین های متصل شونده به پنی سیلین جلوگیری کرده و تحت تاثیر آنزیم های بتالاکتاماز، حلقه ی آسیل آن ها هیدرولیز می شود. PCR: از مهمترین و تاثیر گذارترین تکنیک های ابداع شده در زیست شناسی و پزشکی می باشد، این روش در واقع تکثیرDNA به شکل مصنوعی می باشد. استفاده از PCR برای تشخیص سویه های حامل ژن های کدکننده آنزیم های بتالاکتامازی، مزایای بسیاری دارد که شامل حساسیت زیاد آن در تشخیص الگوهای هدف، سرعت بالا و نتایج قابل اعتماد آن به دلیل اختصاصی بودن فوق العاده آن می باشد. NDM: blaNDM یک متالوبتالاکتاماز کلاس B آمبلر و 3 بوش میباشد. در سال 2009 در دهلی نو گزارش شده است و از آن زمان به بعد به طور گسترده ای در انگلستان و آسیای جنوب شرقی منتشر شده است. در حال حاضر ژن blaNDMدر طیف وسیعی از باکتری های گرم منفی در محیط زیست دهلی نو از جمله در پاتوژن های جدی شیگلا و ویبریوکلرا به طور گسترده ای شناسایی شده است.آنزیم blaNDMباعث می گردد باکتری به آنتی بیوتیک های بتالاکتام به استثناء آزترونام مقاومت نشان می دهد. VIM: blaVIMیک متالوبتالاکتاماز کلاس B آمبلر و 3 بوش می باشد. اولین سویه ی حاوی ژن blaVIM نیز در ایتالیا در سال 1997 مشاهده شد. باکتری های دارای ژن blaVIM قادر به هیدرولیز طیف وسیعی از بتالاکتام ها از جمله پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها و کارباپنم ها هستند، اما توانایی هیدرولیز مونوباکتام(آزترونام)را ندارند. فصل دوم مروری برتحقیقات انجام شده 2-1.تاریخچه جنس اسینتوباکتر بومانی: اوایل قرن 20 در سال 1911 میلادی میکروبیولوژیست آلمانی بنام بیجرینگ ارگانیسمی بنام Calcoaceticus micrococcus را از خاک جدا کرد(.طی دهه های بعد ارگانیسم های مشابهی توصیف شدند که شامل 15 گونه و جنس متفاوت بودند که می توان از آنها نام برد( پلگ و همکاران،2008) : Herellea vaginicol ،Niesseria winogradskyi ،Acromobacter anitratus, Bacterium anitratum ،Alcaligenes heamolysans ،Diplococcus mucosus, Micrococcus calcoaceticus، Mima polymorpHa ،Achromobacter mucosus, Akinetos نام یونانی جنس رایج اسینتوباکتر می باشد که به معنی غیر متحرک می باشد که درسال 1954 توسط بریشوو پریوت برای جدا کردن میکروارگانیسم های غیر متحرک از متحرک های جنس آکروموباکتر به کار گرفته شد. 2-2.تاکسونومی رایج اسینتوباکتر بومانی: اسینتوباکتر(A) کوکوباسیل گرم منفی است که اخیرا در خانواده جدید Moraxelaceae و راسته Gammaproteobacteria قرار می گیرند(روساو و همکاران، 1991). در سال 1986 مطالعاتی بر پایه هیبریداسیون DNA-DNA انجام شد که از 12 گروه DNA 2سویه اصلی A. baumannii, A. calcoaceticus تشخیص داده شد(بویووت و گریمونت 1986). دریافت فایل جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید |