quot;بررسي اثر متقابل قارچ Colletotrichum coccodes عامل - دانلود رایگان
دانلود رایگان سيب زميني با توليد حدود ۳٠٠ ميليون تن در سال، چهارمين محصول مهم غذايي در جهان است. توليد اين محصول همواره با مشکلاتي همراه بوده است. اين گياه در معرض بيمار
دانلود رایگان
| "بررسي اثر متقابل قارچ Colletotrichum coccodes عامل بيماري خال سياه و باکتريRalstonia solanacearum عامل بيماري پژمردگي باکتريايي سيب زميني"چکيده: سيب زميني با توليد حدود ۳٠٠ ميليون تن در سال، چهارمين محصول مهم غذايي در جهان است. توليد اين محصول همواره با مشکلاتي همراه بوده است. اين گياه در معرض بيماريهاي قارچي، باکتريايي، ويروسي و مايکوپلاسمايي زيادي است که به آن خسارت وارد مي کنند. از آنجائيکه دو بيماري خال سياه ناشي از قارچ Colletotrichum coccodesو بيماري پژمردگي باکتريايي ناشي از باکتري Ralstonia solanacearum از اهميت نسبي روي سيب زميني در استان همدان برخوردار هستند و منجر به کاهش عملکرداين گياه مي شوند، مطالعه روي آنها ضروري به نظر رسيد. بنابراين، اثر متقابل اين دو بيمارگر و همچنين تنوع ژنتيکي قارچ C. coccodes و الگوي پروتئيني باکتري R. solanacearum مورد بررسي قرار گرفتند. در اين تحقيق طي نمونهبرداريهاي صورت گرفته در بهار، تابستان و پاييز سال 1386 تعداد70 جدايه قارچ C. coccodesو 30 استرين باکتريR. solanacearumاز بوتههاي آلوده جداسازي گرديد که پس از شناسايي در نهايت 20 جدايه قارچ و 15 استرين باکتري براي بررسيهاي بيشتر انتخاب شدند. اثر متقابل بيمارگرها با دو روش آغشتهسازي غده و خاک روي سه رقم سيبزميني آگريا، بورن و ديامانت مورد بررسي قرار گرفت. پارامترهاي طول، وزن تر و وزن خشک ساقه و ريشه و ميزان کلونيزاسيون ريشه توسط ميکرواسکلروت قارچ اندازهگيري شد. در هر سه رقم در حضور بيمارگرها نسبت به شاهد کاهش وزن و طول ريشه و ساقه مشاهده شد. حضور توأم R. solanacearum و C. coccodes در گياه باعث افزايش حساسيت گياه نسبت به آنها و کاهش بيشتر شاخصهاي مورد اندازهگيري شد. با بررسي نتايج حاصل مشخص شد که رقم آگريا حساسترين رقم نسبت به قارچ و باکتري است و پس از آن رقم بورن و ديامانت قرار دارند. در رقم ديامانت نسبت به باکتري مقاومت نسبي وجود دارد. روشهاي آغشتهسازي غده و خاک تفاوت زيادي در ايجاد بيماري در گياه نداشتند اما در مجموع اينوکولوم غدهزاد مخربتر عمل کرد. در رقم آگريا حساسيت نسبت به قارچ بيش از باکتري ميباشد. وجود باکتري به همراه قارچ توانست اثر منفي آن را روي گياه افزايش دهد اما تفاوت بين تيمار Cc و Rs + Ccدر حد معنيداري نيست. به عبارت بهتر وجود باکتري به ميزان خيلي کمي در افزايش بيماريزايي قارچ مؤثر است. بالعکس وجود قارچ در گياه به شدت بيماريزايي باکتري را افزايش ميدهد. حضور توأم دو بيمارگر وزن تر ريشه را در روش آغشتهسازي خاک 39/61% و در روش آغشتهسازي غده 64/85% کاهش داد. با توجه به شاخص موجود، درصد کلونيزاسيون ريشه توسط ميکرواسکلروت قارچ در رقم آگريا بين 50 تا 70 درصد گزارش گرديد. در رقم بورن در مجموع تواناييC. coccodesو R. solanacearumدر ايجاد بيماري در گياه تقريباً به يک اندازه ميباشد. در اصل ميتوان گفت که حساسيت اين رقم نسبت به دو بيمارگر مشابه است. ميزان کاهش صفات مورد اندازهگيري در رقم بورن نسبت به رقم آگريا کمتر بوده و بنابراين شايد بتوان گفت که اين رقم نسبت به دو بيمارگر مقاومتر ميباشد. کلونيزاسيون کمتر ريشه توسط ميکرواسکلروت قارچ (50%) نيز مؤيد اين مدعا است. در رقم ديامانت در همه موارد کاهش پارامترهاي گياه نسبت به دو رقم ديگر کمتر ميباشد که نشاندهنده مقاومت بيشتر اين رقم نسبت به هر دو بيمارگر ميباشد. در اکثر موارد باکتري با تيمار شاهد از لحاظ آماري يکي شده که نشان دهنده توان بيماريزايي کم باکتري روي اين رقم و وجود مقاومت نسبي در گياه نسبت به باکتري عامل پژمردگي ميباشد. درصد کلونيزاسيون ريشه نسبت به دو رقم ديگر کمتر بوده و حدود 30% ميباشد. به منظور بررسي تنوع ژنتيکي C. coccodes از نشانگر RAPD استفاده گرديد. با استفاده از 10 آغازگر تصادفي تنوع ژنتيکي قابل ملاحظهاي بين اين جدايهها مشاهده گرديد. بر اين اساس، جدايههاي مختلف بر اساس ناحيه جغرافيايي از يکديگر قابل جداسازي نبودند ولي از لحاظ ويژگيهاي بيماريزايي به خوبی از يکديگر تفکيک شدند. همچنين به منظور مقايسه الگوي پروتئيني استرينهاي باکتري پروتئين آنها استخراج و در ژل اکريلآميد 12% الکتروفورز شد. پروتئينها بر اساس وزن مولکولي در يک ميدان الکتريکي از يکديگر جدا شده و پس از رنگآميزي مورد مقايسه قرار گرفتند. در الگوي پروتئيني استرينهاي باکتري تنوعي مشاهده نشد. واژههاي کليدي: برهمکنش، رقم سيب زميني، RAPD، الکتروفورز پروتئين مقدمه 1 فصل اول: بررسی منابع Ralstonia solanacearum6 R. solanacearum9 R. solanacearum11 R. solanacearum13 R. solanacearum16 R. solanacearum17 R. solanacearum18 Colletotrichum coccodes24 C. coccodes36 فصل دوم: مواد و روشها C. coccodes47 R. solanacearum49 C. coccodes49 R. solanacearum50 Colletotrichum coccodes51 Ralstonia solanacearum52 C. coccodes54 R. solanacearum55 C. coccodes55 C. coccodes56 R. solanacearum56 C. coccodes و باکتري R. solanacearumبه خاک57 C. coccodes و باکتري R. solanacearum58 C. coccodes59 C. coccodes62 264 Taq DNA polymerase64 R. solanacearum65 R. solanacearum66 R. solanacearum67 فصل سوم: نتايج و بحث Colletotrichum coccodes70 Ralstonia solanacearum73 C. coccodes75 R. solanacearum78 C. coccodesوR. solanacearum79 C. coccodes و R. solanacearum در رقم آگريا83 C. coccodes و R. solanacearum روي طول ساقه سيبزميني رقم آگريا83 C. coccodes و R. solanacearum روي طول ريشه سيبزمينی رقم آگريا85 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن تر ساقه سيبزميني رقم آگريا86 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن تر ريشه سيبزميني رقم آگريا87 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن خشک ساقه سيبزميني رقم آگريا87 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن خشک ريشه سيبزميني رقم آگريا88 C. coccodes89 C. coccodes و R. solanacearum در رقم آگريا90 C. coccodes و R. solanacearum در رقم بورن91 C. coccodes و R. solanacearum روي طول ساقه سيبزميني رقم بورن91 C. coccodes و R. solanacearum روي طول ريشه سيبزميني رقم بورن92 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن تر ساقه سيبزميني رقم بورن94 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن تر ريشه سيبزميني رقم بورن95 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن خشک ساقه سيبزميني رقم بورن96 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن خشک ريشه سيبزميني رقم بورن97 C. coccodes98 C. coccodes و R. solanacearum در رقم بورن99 C. coccodes و R. solanacearum در رقم ديامانت100 C. coccodes و R. solanacearum روي طول ساقه سيبزميني رقم ديامانت100 C. coccodes و R. solanacearum روي طول ريشه سيبزميني رقم ديامانت102 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن تر ساقه سيبزميني رقم ديامانت102 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن تر ريشه سيبزميني رقم ديامانت103 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن خشک ساقه سيبزميني رقم ديامانت104 C. coccodes و R. solanacearum روي وزن خشک ريشه سيبزميني رقم ديامانت105 C. coccodes106 C. coccodes و R. solanacearum در رقم ديامانت106 R. solanacearumو C. coccodesدر گياه سيبزميني107 R. solanacearum115 پيوست118 منابع.. 124 R. solanacearum7 C. coccodes27 C. coccodes و باکتري R. solanacearum48 C. coccodes و باکتري R. solanacearum59 R. solanacearum66 R. solanacearum73 R. solanacearum74 C. coccodes روي ميوه گوجهفرنگي و آناليز آماري نتايج آن76 C. coccodes و استرينهاي باکتري R. solanacearum80 C. coccodes و استرينهاي باکتري R. solanacearum81 C. coccodes و استرينهاي باکتري R. solanacearum82 C. coccodesو باکتري R. solanacearum84 C. coccodesو باکتري R. solanacearum93 C. coccodesو باکتري R. solanacearum101 C. coccodes112 C. coccodes روي ريشه سيبزميني و پرگنه قارچ روي محيط کشت71 Colletotrichum coccodes، کنيديومها، ميکرواسکلروت و موها، اپرسوريوم72 R. solanacearumدر توتون75 C. coccodes77 C. coccodes77 C. coccodes78 R. solanacearum79 R. solanacearum و C. coccodes به تنهايي و همراه با هم روي طول ساقه در سيبزميني.........83 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي طول ريشه سيبزميني85 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزن تر ساقه سيبزميني86 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزنتر ريشه سيبزميني87 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزن خشک ساقه88 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزن خشک ريشه89 C. coccodes90 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي طول ساقه سيبزميني92 R. solanacearum و C. coccodes به تنهايي و همراه با هم روي طول ريشه سيبزميني94 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزنتر ساقه سيبزميني95 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزنتر ريشه سيبزميني96 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزن خشک ساقه97 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزن خشک ريشه98 C. coccodes......99 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي طول ساقه سيبزميني100 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي طول ريشه سيبزميني102 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزنتر ساقه سيبزميني103 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزنتر ريشه سيبزميني104 R. solanacearum و C. coccodes به تنهايي و همراه با هم روي وزن خشک ساقه105 R. solanacearum و C. coccodesبه تنهايي و همراه با هم روي وزن خشک ريشه106 C. coccodes107 C. coccodesروي ژل آگارز در مقايسه با DNA فاژ λ.110 C. coccodes111 C. coccodes112 C. coccodes با نشانگر RAPD با رسم دندروگرام114 R. solanacearum جدا شده از سيبزميني در ژل پلياکريلآميد 12%116 مقدمه الف- تاريخچه گياه سيب زميني سيبزميني بومي امريکاي جنوبي بوده و منشاء آن کشور پرو و بوليوي ميباشد و براي اولين بار حدود 7000 سال پيش در پرو کاشته شده است. بنا به باور باستانشناسان، سيبزميني از حدود 2000 سال پيش از ميلاد مسيح توسط اينکاها در بخشهاي کوهستاني اين کشور کاشته شده است. اين گياه در سال 1573 وارد اسپانيا شد و به عنوان يک منبع غذايي مورد توجه قرار گرفت و به تدريج از اسپانيا به ديگر کشورهاي اروپايي برده شد. تا حدود 150 سال سيبزميني تنها در مناطق محدودي از اروپا در کاخهاي سلطنتي و باغچه خانهها کاشته ميشد. در سال 1719 از اروپا به امريکاي شمالي و سپس به آسيا برده شد. تاريخچه کشت اين گياه در قاره افريقا به حدود 50 سال پيش برميگردد. حدود 200 سال پيش (در زمان فتحعليشاه قاجار) مقداري بذر سيبزميني به ايران آورده شد. اين بذرها ابتدا در يکي از روستاهاي تهران کاشته شده و سپس به فريدن اصفهان و به تدريج به ساير نقاط کشور برده و کشت شد (شجاعي، 1383). ب- مشخصات گياهشناسي سيبزميني گياهي دولپه، يکساله و از خانواده Solanaceae ميباشد. برگها مرکب، گلها پنج قسمتي و داراي رنگهاي متفاوتي هستند. ميوهها گرد تا تخممرغي (قطر 3-1 سانتيمتر يا بيشتر)، سبز رنگ، سبز متمايل به قهوهاي يا قهوهاي بوده و به هنگام رسيدن قرمز تا بنفش رنگ ميشوند و حاوي بيش از 200 تا 300 بذر هستند. ساقه معمولاً سبز رنگ است اما گاهي قرمز يا بنفش، زاويهدار، علفي و در اواخر فصل در قسمتهاي پاييني نسبتاً چوبي ميشود. ريشهها منشعب و نيمه عميق هستند که حداکثر عمق فعاليت آنها 60 سانتيمتر ميباشد ( هوكر[1]، 1990). لقاح در اين گياه به صورت خودگشني است و از لحاظ زمان رسيدن به ارقام زودرس، ميانرس و ديررس تقسيم ميشود. اغلب گونههايي که به طور معمول مورد کشت قرار ميگيرند تتراپلوئيد (2n=4x=48 کروموزوم) هستند. همچنين چهار گونه ديپلوئيد (24 کروموزوم)، دو گونه تريپلوئيد (36 کروموزوم) و يک گونه پنتاپلوئيد (60 کروموزوم) نيز گاهي مورد کشت قرار ميگيرند. مهمترين گونهاي که در سراسر جهان کشت ميشود Solanum tuberosum ميباشد که يک گونه تتراپلوئيد است و داراي دو زير گونه andigena وtuberosum ميباشد. زير گونه andigena با طول روز کوتاه سازگاري پيدا کرده و زير گونه tuberosum با طول روز بلند سازگار است. بررسيهاي ژنتيکي نشان دادهاند که 32 رقم مورد کشت در هند از زير گونه tuberosum به دست آمدهاند. ج- شرايط محيطي سيبزميني به طور مشخص متعلق به مناطق معتدل سرد با ارتفاع تقريبي 2000 متر يا ارتفاعات بالاتر در مناطق گرمسيري است. اين گياه به شبهاي خنک و خاک داراي زهکشي مناسب و رطوبت کافي نياز دارد و در عرضهاي جغرافيايي پايين در مناطق گرم توليد خوبي ندارد (هوكر، 1990). خاک لومي- شني حاصلخيز براي اين گياه مناسب است. دماي مناسب براي رشد 20-15 درجه سانتيگراد است و دماي بالاي 29 درجه توليد غده را کاهش ميدهد. اين محصول تا انتهاي دوره رشد به 9-7 بار آبياري نياز دارد. د- اهميت اقتصادي و سطح زير کشت سيبزميني مهمترين گياه دولپهاي است که به عنوان منبع غذايي انسانها مورد استفاده قرار ميگيرد. اين گياه بعد از گندم، برنج و ذرت چهارمين محصول مهم غذايي در جهان است. ميزان توليد ماده خشک سيبزميني در واحد سطح به ترتيب 04/3، 68/2 و 12/1 برابر از گندم، جو و ذرت بيشتر است. مقدار پروتئين آن نيز بيشتر از گندم، جو و ذرت ميباشد. طبق آمار سازمان خوار و بار جهاني کشاورزي (FAO)[2] در سال 2007، ميزان توليد کل سيبزميني در جهان 321736483 تن گزارش شده که بيشترين سهم مربوط به چين[3] با 72040000 تن و کمترين ميزان مربوط به بنين[4] با توليد 30 تن ميباشد. سهم ايران 5240000 تن ميباشد. در قاره آسيا توليد کل 135607646 تن بوده و چين و بحرين به ترتيب بيشترين و کمترين توليد را دارا هستند. طبق گزارش آمارنامه کشاورزي ايران سطح زير کشت، توليد و عملکرد سيبزميني در سال زراعي 84-83 به قرار زير ميباشد: ه- بيماريهاي سيبزميني هر گياهي در طول دوره رشد خود دستخوش آسيبهاي مختلف ناشي از شرايط محيطي نامناسب (آب و هوا، نور، رطوبت و خاک)، حمله آفات و عوامل بيماريزا (قارچ، باکتري، ويروس، نماتد و مايکوپلاسما) ميباشد. در واقع بيماري به برهمکنش بين ميزبان و بيمارگر گفته ميشود که توليد و قابليت استفاده محصول را دچار مشکل ميکند. شرايط محيطي نامساعد حتي در غياب عامل بيماريزا به تنهايي براي صدمه به گياه کفايت ميکند. گياه سيبزميني نيز از اين آسيبها در امان نيست. تحت تأثير عوامل محيطی و ژنتيکی و نوع رقم، ممکن است ميزان محصول، اندازه غدهها و بازارپسندي آنها کاهش يابد. عوامل قارچي، باکتريايي، ويروسي، مايکوپلاسمايي و نماتدهاي زيادي به سيبزميني حمله ميکنند. براي مثال در سال 1845 بيماري ليت بلايت[5] ناشي از قارچ Phytophthora infestansبه سرعت در غرب ايرلند گسترش يافت و باعث از بين رفتن قسمت اعظم محصول سيبزميني شده و قحطي شديدي را در پي داشت. از جمله بيماريهاي قارچي مهم ميتوان به شانکر رايزوکتونيايي ناشي از Rhizoctonia solani، پژمردگيهاي فوزاريومي و پوسيدگي ريشه فوزاريومي ناشي از گونههاي Fusarium، پژمردگي ورتيسيليومي ناشي از Verticillium albo-atrum، پوسيدگي ساقه ناشي از Sclerotium rolfsii، کپک سفيد ناشي ازSclerotinia sclerotiorum، پوسيدگي صورتي با عامل Phytophthora erythroseptica، لکه موجي ناشي از Alternaria solaniو خال سياه ناشي از Colletotrichum coccodesاشاره کرد. باکتريهايPectobacterium carotovorum pv.carotovorum عامل ساق سياه، Erwinia spp. عامل ايجاد پوسيدگي نرم، Streptomyces scabiesعامل جرب پودريو Ralstonia solanacearum عامل پژمردگي باکتريايي از جمله عوامل باکتريايي زيانآور سيبزميني هستند. نماتد طلايي سيبزميني (Globodera rostochinensis)، نماتد مولد زخم غده (Pratylenchus penetrans) و ويروس X سيبزميني از جمله ديگر عوامل بيماريزا به شمار ميآيند. و- اهميت موضوع تحقيق ازآنجاکه استان همدان يکي از مراکز مهم سيبزمينيکاري کشور محسوب ميشود و قارچ C. coccodes و باکتري R. solanacearum از عوامل بيماريزاي مهم اين گياه در اين منطقه هستند، انجام تحقيقي پيرامون آنها ضروري به نظر رسيد. اين عوامل در مزارع سيبزميني استان وجود داشته و خسارات قابل توجهي را به اين محصول وارد ميسازند. به دليل اينکه تکثير سيبزميني با استفاده از غده صورت ميگيرد و همچنين اين دو بيمارگر توسط غده نيز منتقل ميشوند و احتمال آلودگي خاک نيز حتماً وجود دارد، بسته به شرايط، بيماريهای مذکور تقريباً هر ساله خسارت زيادی به محصول سيبزمينی وارد میسازند. همانطورکه ميدانيم گياه در يک زمان ميتواند تحت تأثير عوامل بيماريزاي مختلف قرار گيرد. حضور يک بيمارگر به همراه ساير عوامل بيماريزا در گياه ممکن است اثراتي روي يکديگر داشته باشند. پيرامون اين موضوع تحقيقات متعددي در دنيا انجام شده که به مواردي از آنها اشاره ميشود. برهمکنش بين چهار عامل R. solani، V. dahliae، C. coccodesو Pratylenchus penetransميزان کلونيزاسيون بافتهاي ريشه و ساقه را تحت تأثير قرار ميدهد (کاتکان[6] و همکاران، 1985). بر اساس مطالعات صورت گرفته توسط تسرور[7] و هازانوفسکي[8] (2001)، تلقيح همزمان C. coccodes و V. dahliaeروي ايجاد علائم در ارقام مختلف سيبزميني اثرات متفاوتي داشته است. در ادامه اين بررسيها و به منظور آگاهي از وجود يا عدم وجود چنين روابطي بين قارچ و باکتري مورد نظر تصميم بر انجام اين تحقيق گرفته شد. دانستن اين موضوع ميتواند تا حدي در مديريت بيماري و به تبع آن کاهش خسارت و هزينهها موثر باشد و لزوم استفاده از غدههاي عاري از آلودگي، کشت در خاک بدون آلودگي و استفاده از آب سالم را گوشزد نمايد. افزايش استفاده از تکنيکهاي بيولوژي مولکولي در بيماريشناسي گياهي در چند سال گذشته باعث افزايش تعداد مقالات در نشريات قارچشناسي و بيماريشناسي گياهي شده که حاوي اطلاعات زيادي راجع به تغييرات ژنتيکي بيمارگرهاي گياهي هستند. تقريباً همه بيمارگرهاي گياهي داراي تنوع درونگونهاي و بينگونهاي هستند. اين تنوع با تکنيکهاي مختلف قابل بررسي است. اين تکنيکها به سه دسته تقسيم ميشوند: روشهاي مبتني بر ويژگيهاي ظاهري، روشهاي مبتني بر DNA و روشهاي مبتني بر پروتئين. SDS-PAGE[9] يکي از روشهاي مورد استفاده در بررسيهاي مولکولي است و براي تفکيک زيرواحدهاي پروتئيني و فرآوردههاي حاصل از پيسيآر[10] استفاده ميشود. به منظور بررسي الگوي پروتئيني موجودات مختلف، پروتئين آنها استخراج و در ژل پلياکريل آميد در ميدان الکتريکي قرار داده ميشود. پروتئينها بر اساس وزن مولکولي در داخل ژل از هم جدا ميشوند. پس از طي مراحل مختلف اعم از رنگآميزي و رنگبري، باندهاي پروتئيني در ژل قابل روئيت بوده و ميتوان آنها را مورد بررسي قرار داد. به منظور بررسي تنوع درونگونهاي قارچ C. coccodes از نشانگر مولکولي RAPD استفاده شد. RAPD کاربرد زيادي در مطالعات مولکولي دارد و از لحاظ اقتصادي به صرفه ميباشد. 1- بررسی منابع 1-1- باکتریRalstonia solanacearum 1-1-1- مقدمه بيشتر از صد سال از زمان چاپ اولين توصيف کامل راجع به باکتريRalstonia solanacearumE.F. Smith، عامل پژمردگي گياهان خانواده سولاناسه، توسط اسميت[11] ميگذرد (اسميت، 1896). در آن زمان اسميت کاملاً متوجه اهميت جهاني اين باکتري نشده بود. با وجود اين، او اولين شخصي بود که مشکلي را که بسياري از محققين در مطالعه عامل بيماري در محيط کشت با آن مواجه بودند را حل کرد. به دنبال آن و با گذشت سالها بيش از 2000 مقاله در مورد اين باکتري به زبانهاي مختلف به چاپ رسيده است. طبق گزارش OEPP/EPPO در سال 2004، اين باکتري براي اولين بار اواخر قرن نوزدهم از روي سيبزميني، توتون، گوجهفرنگي و بادامزميني از آسيا، امريکاي جنوبي و جنوب ايالات متحده گزارش شد. چندين مقاله مروري که در برگيرنده بيولوژي، اپيدميولوژي، برهمکنش بين ميزبان و بيمارگر و ژنتيک R. solanacearumهستند توسط محققيني مثل بادنهاگن[12] (1986)، هيوارد[13] (1991)، بوچر[14] و همکاران (1992) و دني و شل[15] (1992) به چاپ رسيده است. اگرچه تخمين زيانهاي اقتصادي وارد آمده توسط پژمردگي باکتريايي به صورت مستقيم و غير مستقيم درگذشته و حال مشکل است، اما اين بيماري اگر مهمترين بيماري باکتريايي نباشد، در زمره مهمترين آنها در جهان قرار ميگيرد. هيچ بيماري باکتريايي از لحاظ تعداد واقعي محصولاتي نظير موز، بادامزميني، سيبزميني، توتون و گوجهفرنگي که هر ساله توسط اين باکتري از بين ميروند، مشابه اين بيماري نيست. علاوه بر اين، تعداد کمي از بيماريهاي قارچي و ويروسي از لحاظ تنوع، دامنه ميزباني، پراکنش جغرافيايي و اهميت اقتصادي قابل مقايسه با آن هستند. Solanaceae نظير سيبزميني و توتون در آن زمينها صورت گرفت. از آنجائيکه اکثر استرينهاي باکتري به دماي پايين حساس هستند، پراکنش باکتري محدود به مناطق مهم کشت سيبزميني در جهان شده است; البته توجه به گسترده شدن محدوده پراکنش باکتري به دليل وجود استرينهاي متحمل به دماي نسبتاً پايين، ما را به سمت انجام اقدامات مناسب جهت تضمين آينده توليد سيبزميني سوق ميدهد (کلمن و همکاران[16]، 1994). 1-1-2- اسامي و موقعيت تاکسونوميکي R. solanacearum ( به نقل از دانکل[17]، 2007 )
1-1-3- خصوصيات R. solanacearumيک بيمارگر خاکزاد است که عامل مهمي در محدود کردن توليد بسياري از گياهان در سرتاسر جهان ميباشد و عامل پژمردگي باکتريايي و پوسيدگي قهوهاي سيبزميني، پژمردگي باکتريايي يا پژمردگي جنوبي گوجهفرنگي، بادمجان، توتون و بعضي از گياهان زينتي وهمچنين بيماري موکوي موز است (اگريوس[18]، 1997). استرين بيماريزايسيبزميني روي توتون بيماريزايي ضعيفي دارد و روي موز غيربيماريزا است. استرين مربوط به موز هم نميتواند روي سيبزميني ايجاد بيماري کند. در مقابل، استرينهاي بيمارگر گوجهفرنگي و توتون معمولاً قادر به بيمار کردن سيبزميني هستند (هوکر، 1990). R. solanacearumيک باکتري گرم منفي، غيرفلورسنت، ميلهاي شکل و هوازي اجباري است که اندازهاي بين 7/0 - 5/0 در 2 - 5/1 ميکرومتر دارد و داراي يک تاژک قطبي و فاقد کپسول و اسپور است. دماي بهينه رشد براي اکثر استرينها بين 32 - 28 درجه سانتيگراد ميباشد (هيوارد، 1991؛ شاد[19] و همکاران، 2001). کلوني باکتري روي سطح آگار و در دماي 28 درجه سانتيگراد معمولاً بعد از گذشت 48 - 36 ساعت ظاهر ميشود. کلونيهاي تيپ بيماريزا سفيد يا کرم رنگ، داراي شکل نامنظم، لعابدار و مات هستند. در اثر ايجاد موتاسيون کلونيهاي غيربيماريزا هم ظاهر ميشوند که شکل منظمي دارند، کوچکتر و فاقد لعاب هستند. محيط TTC[20] (کلمن، 1954) قادر به جداسازي اين دو تيپ کلوني از يکديگر است; در واقع روي اين محيط کلونيهاي بيماريزا به رنگ سفيد با مرکز صورتي و کلونيهاي غيربيماريزا به رنگ قرمز تيره هستند (چامپويزو[21] و همکاران، 2009). R. solanacearum سالها در آب معمولي، آب مقطر و يا آب ديونيزه استريل زنده ميماند. همچنين نگهداري باکتري به مدت طولاني در محيط کشت مايع حاوي 10% گليسرول و در دماي 80- درجه سانتيگراد امکانپذير است. کشت متوالي روي سطح آگار باعث از بين رفتن قدرت بيماريزايي بيمارگر شده و باکتري روي سطح محيط کشت و در دماي 4 درجه سانتيگراد قادر به زنده ماندن نيست. اين باکتري در شرايط خاصي مثل قرار گرفتن در معرض دماهاي پايين، وارد يک حالت زنده اما غيرقابل کشت ميشود (VBNC[22]) که ممکن است روشهاي تشخيصي مبتني بر کشت را با مشکل مواجه کند (ونالساس[23] و همکاران، 2001). کاتالاز، اکسيداز و نيتراترداکتاز در اين باکتري مثبت است، نشاسته و اسکولين را هيدروليز نميکند، به سختي قادر به هيدروليز ژلاتين است، از سوکروز توليد لوان نميکند، در 41 درجه سانتيگراد رشد نميکند، در 8 pH: ضعيف و در 4 pH: و 9 pH: اصلاً رشد نميکند. در غلظت نمک بالاي 2% قادر به رشد نيست. 1-1-4- بيماريزايي R. solanacearum باکتري R. solanacearum يک بيمارگر خاکزاد است که از طريق زخمها يا منافذ طبيعي موجود در محل خروج ريشههاي فرعي وارد ريشه گياه ميشود. انتقال توسط حشرات هم در مورد برخي از استرينهاي بيماريزاي موز گزارش شده است. باکتري در ابتدا فضاهاي بين سلولي بافت کورتکس ريشه و پارانشيم آوندي را کلونيزه کرده و با تخريب ديواره سلولي، گسترش خود را در سيستم آوندي تسهيل ميکند. در نهايت آوندهاي چوبي که مسئوليت انتقال آب و مواد غذايي را بر عهده دارند، مورد حمله قرار ميگيرند (واس[24] و همکاران، 1995؛ واليز و تروتر[25]، 1978؛ جنين و بوچر[26]، 2004). باکتري پس از ورود به آوندهاي چوبي، تکثير يافته (بيشتر از 1010 سلول باکتري در هر سانتيمتر ساقه گوجهفرنگي) و سريعاً در سيستم آوندي گياه پخش ميشود. نتيجه حضور گسترده باکتري در گياهان حساس ايجاد پژمردگي، زردي، توقف رشد، نکروز و نهايتاً مرگ ميباشد. باکتري نهايتاً وارد خاک شده و به صورت ساپروفيت باقي ميماند تا ميزبان جديد در دسترس آن قرار گيرد (لمسا اوکو[27]،2006). در مورد اتفاقات اوليه رخ داده در توسعه اين بيماري و فاکتورهاي مؤثر در کلونيزاسيون سيستميک و سريع گياه توسط باکتري اطلاعات زيادي در دسترس نيست. باکتري قادر است بدون ايجاد بيماري در سيستم آوندي گياه پيشرفت کند (الفينستون[28]، 1996 و هيوارد، 1991). با وجود اهميت آلودگي پنهان از لحاظ اپيدميولوژيکي، فاکتورهاي مؤثر در استقرار و بقاء جمعيت باکتري در ميزبانهاي بدون علامت هنوز ناشناخته باقي مانده است (پراير[29] و همکاران، 1998). براي آغاز برهمکنش بين گياه و بيمارگر، باکتري ابتدا بايد ميزبان مناسب خود را شناسايي کند. اين امر ميتواند براي فعالسازي ژنهايي که محصولات آنها براي ادامه برهمکنش لازم هستند، به باکتري کمک کند. بيش از ده سال است که مشخص شده مولکولهاي کوچک منتشره از گياهان نقش مهمي را در اين پروسه شناسايي، با تحريک انواعي از ژنها در باکتريهاي مرتبط با گياهان، ايفا ميکنند. اين پديده ابتدا در Agrobacterium tumefaciensديده شد. از جمله در بافتهاي آسيبديده گياه، گروهي از ترکيبات فنولي با ساختاري متفاوت از جمله استوسيرينگون[30] يافت شدند (استاکل[31] و همکاران، 1985). دريافت اين سيگنالهاي فنولي باعث فعالسازي ژنهاي بيماريزايي (vir) لازم براي انتقال T-DNA به داخل سلول ميزبان، در سطح رونويسي ميشود. فاکتورهاي مختلفي در بيماريزايي R. solanacearum دخالت دارند که از جمله آنها ميتوان به پليساکاريدهاي خارج سلولي (EPS[32])، آنزيمهاي مختلف و پيلي[33] يا فيمبريا[34] اشاره کرد. در اين بين، پليساکاريدهاي خارج سلولي از اهميت بيشتري برخوردار هستند. الف- پليساکاريدهاي خارج سلولي (EPS) EPS به صورت لعاب يا کپسول اطراف سلول باکتري وجود دارد که بيشتر به صورت يک لعاب سيال و بي شکل است و به آساني توسط آب شسته ميشود (بادنهاگن[35] و کلمن، 1964؛ سکويرا[36]، 1985). در برهمکنش بين گياه و بيمارگر، لعاب با مسدود کردن عناصر آوندي و کاهش انتقال آب به قسمتهاي مختلف گياه و همچنين حفاظت باکتري در مقابل ترکيبات دفاعي گياه، نقش مهمي را در بيماريزايي ايفا ميکند (کاترجي[37] و همکاران، 1986؛ دني و بيک[38]، 1991؛ کائو[39] و همکاران، 1992). محققين با ايجاد موتاسيون در ژن توليد کننده EPS متوجه شدند که اگرچه اين موتانتها به طور کامل غير بيماريزا نيستند، اما کلونيزاسيون ضعيف ساقه گياهان آلوده توسط آنها نشان دهنده دخالت EPS در کاهش يا عدم شناسايي اندامکهاي سطحي باکتري توسط مکانيزم دفاعي گياه است (آراد رازو[40] و همکاران، 1998؛ سيل[41] و همکاران، 1997). شواهد زيادي مبني بر اهميت EPS در بيماريزايي R. solanacearum وجود دارد. بادنهاگن و کلمن (1964) و حسين و کلمن (1958) دريافتند که موتانتهاي فاقد لعاب هميشه دچار کاهش بيماريزايي ميشوند، در مقابل آنهايي که لعاب زيادي توليد ميکنند به شدت بيماريزا هستند. ارتباط بين EPS و بيماريزايي با ايجاد موتانتهاي به دست آمده از طريق تحريک ترانسپوزان[42]، بهتر مشخص شده است. حداقل سه دسته ژن در توليد EPS دخالت دارند. کلاستر ops (کوک[43] و سکويرا، 1991؛ کائو و سکويرا ، 1991؛ زو[44] و همکاران، 1988) حداقل شامل 7 قسمت است که ايجاد جهش در هر کدام از آنها توليد EPS و همچنين LPS[45] را تحت تأثير قرار ميدهد. دو کلاستر ديگر توسط دني و همکاران (1991 و 1988) شناسايي شده و EPSІ و EPSІІ نام دارند. ايجاد موتاسيون در EPSІ باعث جلوگيري از بيان EPS در گياه و محيط کشت شده و ايجاد جهش در EPSІІ تنها در محيط کشت مانع توليد EPS ميشود. 1-1-5- تاکسونومي R. solanacearum در مطالعه تاکسونوميکي بعضي از گونههاي غيرفلورسنت جنس Pseudomonas (يابوچي و همکاران، 1992) مشخص شد که جنس Burkholderia در اين گروه داراي تفاوتهايي با ديگر اعضاء است و بنابراين نام B. solanacearum پيشنهاد شد. مطالعات بيشتر نشان داد که R. solanacearum به اندازه کافي با اين جنس متفاوت است و ميتواند به جنس جديدي انتقال يابد و در سال 1995 توسط يابوچي[46] و همکاران به جنس Ralstonia انتقال داده شد. به دليل تنوع قابل ملاحظه موجود در اين باکتري، R. solanacearum به عنوان يک گروه گونهاي تلقي ميشود (فگان[47] و پراير، 2005). اين باکتري بر اساس دامنه ميزباني به 5 نژاد و بر اساس استفاده از چند کربوهيدرات مختلف به 6 بيووار تقسيم شده است (دني، 2006) اما به نظر ميرسد که اين طبقهبندي قديمي خيلي مناسب نباشد. به دليل دامنه ميزباني وسيع و گاهيoverlap، روشهاي آزمايشگاهي براي تعيين نژاد وجود ندارد. بيووارها، به استثناي بيووار 2 که مرتبط با نژاد3، بيووار2 است، متعلق به گروههاي فايلوژنتيکي مشابه نيستند. علاوه بر اين، مشخص شده که زيرگروهي از بيووار 2 به نام بيووار 2T، هم در استرينهاي جدا شده از آسيا و افريقا و هم در استرينهاي امريکاي جنوبي يافت شده که نشاندهنده اين است که تستهاي قديمي تعيين بيووار براي اقدامات تشخيصي داراي اعتبار نيستند. اوکاب و گوتو[48] (1963) استرينهاي R. solanacearum را بر اساس ويژگيهاي فنوتيپي، سرولوژيکي، phagetyping و حساسيت به باکتريوسين به بيش از 40 گروه تقسيم کردهاند. پالروني[49] و همکاران (1972 و 1973) با مطالعات DNA-DNA hybridization و RNA-DNA hybridization جنس Pseudomonas را در 5 گروه همولوژي قرار دادند که اين گروهبندي توسط مطالعات صورتگرفته پيرامون ويژگيهاي فنوتيپي، آناليز اسيدهاي چرب، آيزوزايمها، حساسيت به فاژها و توالييابي DNA، توسط محققين ديگر نيز مورد تأييد قرار گرفت (لي[50] و همکاران، 1993). اخيراً يکسري روشهاي طبقهبندي معتبر از لحاظ فايلوژنتيکي بر اساس آناليز توالي ناحيه ITS ابداع شده است (فگان و پراير، 2005؛ پراير و فگان، 2005؛ پوزير[51] و همکاران، 2000). اين سيستم، کمپلکس گونهاي را به 4 فايلوتايپ تقسيم ميکند که به ميزان زيادي نشاندهنده روابط ژنتيکي و جغرافيايي اين استرينها است. استرينهاي فايلوتايپ І از آسيا، استرينهاي فايلوتايپ ІІ از امريکا، استرينهاي فايلوتايپ ΙΙΙ از افريقا و استرينهاي فايلوتايپ ІV از اندونزي (بيووار 1، 2 و2T) جدا شدهاند. فايلوتايپ І و ІІ منطبق با شاخه 1 و 2 توصيف شده توسط کوک و همکاران هستند( 1989). بر اساس توالي ژن اندوگلوکوناز (egl)، اين فايلوتايپها به چند سکيووار[52] تقسيم ميشوند (فگان و پراير، 2005؛ پراير و فگان، 2005). طبقهبندي بر اساس توالي چند جايگاهي و ديگر بررسيها مؤيد اين مسئله است که اين سيستم طبقهبندي منعکس کننده فايلوژني اين گروه است. بر اين اساس، استرينهاي نژاد 3، بيووار 2 باکتري R. solanacearum متعلق به فايلوتايپ 2 و سکيووار 1 و 2 هستند (فگان و پراير، 2005). بر اساس RFLP و ديگر مطالعات انگشتنگاري ژنتيکي (هيوارد، 2000؛ سيل[53] و همکاران، 1999؛ تقوي و همکاران، 1996) اين باکتري به دو شاخه با منشاء جغرافيايي متفاوت تقسيم ميشود: شاخه І (بيووار 3، 4 و 5 منشاء گرفته از آسيا) و شاخه ІІ (بيووار1، 2A و 2T منشاء گرفته از امريکاي جنوبي). 1-1-6- علائم بيماري پژمردگي باکتريايي ناشي از R. solanacearum الف- روي سيبزميني نژاد 3، بيووار 2 باکتري R. solanacearum روي سيبزميني و گوجهفرنگي علائم مشابهي ايجاد ميکند که قابل تشخيص از علائم پژمردگي ايجاد شده توسط ديگر استرينهاي R. solanacearum نيستند. اولين علائم قابل مشاهده، پژمردگي برگهاي جوان در ساعات گرم روز است و گاهي تنها در يک سمت برگچه ويا در يک ساقه ديده ميشودکه در شب ممکن است بهبود يابد. در شرايط مساعد، ممکن است کل گياه سريعاً پژمرده شود که باعث پژمردگي و زردي کل اندام هوايي و نهايتاً مرگ گياه ميشود. برگهاي پژمرده سبز خشک ميشوند. علامت معمول ديگر که در مزرعه به همراه پژمردگي ديده ميشود، توقف رشد است. اين علائم ممکن است در هر مرحله رشدي گياه ديده شوند. گاهي اوقات گياه گوجهفرنگي تا قبل از رسيدن ميوهها علائمي را نشان نميدهد اما درست در همين موقع گياه سريعاً پژمرده ميشود (آلن[54] و همکاران، 2001). همچنين روي ساقه تا دو سانتيمتري بالاي خاک تغيير رنگي به صورت رگههاي قهوهاي ديده شده و برگها رنگ برنزه به خود ميگيرند. با برش طولي ساقهها و استولونهاي آلوده نوارهاي بلند و باريک به رنگ قهوهاي تيره در عناصر آوندي ديده ميشود. در ارقام خيلي حساس ساقهها ممکن است با وجود شاداب بودن روي زمين بيفتند و شيرابهسفيد-خاکستري باکتري در سطح ساقه ديده شود. درسيبزميني با پيشرفت بيماري، علائم پوسيدگي قهوهاي ممکن است روي غده نيز قابل مشاهده باشد. علائم ممکن است با علائم پوسيدگي حلقوي ناشي از Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicusاشتباه گرفته شوند (EPPO/CABI، 1996). R. solanacearum در غدههاي آلوده توسط شيرابه خارج شده از محل چشمکها و محل اتصال غده به انتهاي ساقه قابل تشخيص است. در محل چشمک، تودهاي از خاک به سطح غده چسبيده است. با برش غدههاي آلوده مشاهده ميشود که حلقه آوندي و بافتهاي اطراف آن قهوهاي و نکروز شدهاند که با پيشرفت بيماري تغيير رنگ به مغز غده و بافت کورتکس هم نفوذ ميکند. بلافاصله پس از بريدن ساقه، مايع کرمرنگي به طور خود به خود از سطح آوندها خارج ميشود. لکههاي غيرمعمول شامل لکههاي نکروزه روي سطح اپيدرم نيز ممکن است بعد از آلودگي عدسکها ديده شوند که اين علائم توسط رودريگز نتو[55] و همکاران در سال 1984 توصيف شدهاند. گياهان داراي علائم هوايي ناشي از اين باکتري ممکن است هم غدههاي سالم و هم غدههاي آلوده توليد کنند. اين در حالي است که گياهان بدون علامت هم گاهي غدههاي آلوده توليد ميکنند. ب- روي گوجهفرنگي برگهاي جوانتر زودتر علائم آلودگی را نشان میدهند و ظاهري شل و افتاده به خود ميگيرند که معمولاً در مواقع گرمتر روز اتفاق ميافتد. اگر شرايط محيطي براي بيمارگر مساعد باشد ممکن است کل گياه سريعاً پژمرده شود. تحت شرايط نامساعد پيشرفت بيماري خيلي کند صورت ميگيرد و ممکن است گياه دچار توقف رشد شده و تعداد زيادي ريشههاي نابهجا روي ساقه تشکيل شود. بافتهاي آوندي ساقه قهوهاي رنگ شده و با برش ساقه، قطرات زرد يا سفيد رنگ باکتري قابل مشاهده هستند (مککارتر[56]، 1991). ج- روي شمعداني در شمعداني علائم پژمردگي جنوبي ميتواند خيلي مختصر و قابل چشمپوشي باشد. علائم معمولاً با کلروز و پژمردگي برگهاي پاييني آغاز ميشود و به سمت بالا گسترش مييابد که به صورت پيچيدگي حاشيه برگها است. در اين مرحله از بيماري گياه شب هنگام و در هواي خنک بهبود مييابد اما در شرايط مساعد، بيماري سريعاً در گياه گسترش يافته و پژمردگي از قسمتهاي پيرتر به سمت قسمتهاي جوانتر پيش ميرود. روي برگهاي آلوده نواحي کلروزه گوه شکلي ايجاد ميشود که رفته رفته به صورت نکروز درميآيد. حاشيه برگها هم ممکن است کلروزه و سپس نکروزه شده و نهايتاً همه گياه خشک شده و ميميرد. در مراحل انتهايي بيماري، ساقه ممکن است روي زمين بيفتد. همچنين در آوندهاي ساقه و ريشه نيز تغيير رنگ مشاهده ميشود که تيرهتر شده و نهايتاً نکروزه ميشود. قابل ذکر است که ظهور علائم در شمعداني با افزايش دما (35-29 درجه سانتيگراد) بيشتر ميشود. اگرچه اين باکتري به آساني گياه شمعداني را آلوده ميکند، اما بيمارگر مهمي روي آن به حساب نميآيد. بنابراين، بيمارگر ميتواند باعث ايجاد آلودگي پنهان شود و گياهان داراي آلودگي پنهان ممکن است ماهها علائمي نداشته باشند و سالم به نظر برسند (سوانسون[57] و همکاران، 2005). د- روي توتون يکي از علائم مهم، پژمردگي يک طرفه و زردي زودرس است. به اين ترتيب که برگهاي يک طرف گياه يا حتي يک نيمه برگ دچار پژمردگي ميشوند. در موارد حاد، برگها بدون تغيير رنگ پژمرده شده و متصل به ساقه باقي ميمانند. مثل گوجهفرنگي بافتهاي آوندي به قهوهاي تغيير رنگ ميدهند و ريشههاي اوليه و ثانويه نيز به رنگ قهوهاي تا سياه در ميآيند (اکاندي[58]، 1991). 1-1-7- چرخه بيماري و اپيدميولوژي باکتريR. solanacearumگياهان ميزبان را از طريق ريشهها آلوده ميکند، به اين ترتيب که از طريق زخمهاي ناشي از خروج ريشههاي فرعي و ميکرواورگانيسمهاي موجود در خاک (نظير نماتد عامل زخم ريشه) وارد گياه ميشود. همچنين باکتري ميتواند از طريق زخمهاي ايجاد شده روي ساقه توسط حشرات و وسايل و ادوات مختلف وارد گياه شود. پس از ورود به داخل گياه از طريق آوندهاي چوبي کل گياه را کلونيزه ميکند. شديدترين حالت بيماري در دماي بين 24 تا 35 درجه سانتيگراد ايجاد شده و قدرت بيماريزايي در دماي بالاي 35 درجه و زير 16 درجه کاهش مييابد (سيامپي[59] و سکويرا، 1980؛ هيوارد، 1991). تکثير رويشي، خصوصاً از طريق غدههاي بذري داراي آلودگي پنهان و قلمههاي آلوده شمعداني نقش مهمي را در انتشار نژاد 3، بيووار 2 باکتري ايفا ميکند. انتقال باکتري از گياهي به گياه ديگر زماني اتفاق ميافتد که باکتري از ريشه گياه آلوده خارج و به ريشه گياه سالم نفوذ کند. بيمارگر ميتواند توسط ماشينآلات و همچنين آبهاي سطحي پس از آبياري و بارش باران، از زمينهاي آلوده به زمينهاي سالم انتقال يابد. باکتري به وسيله آبياري و يا سيل ميتواند از درياچهها و زمينهاي آلوده به زمينهاي سالم راه يابد. باکتري R. solanacearumيک بيمارگر خاکزاد يا آبزاد است. باکتري قادر است روزها و يا سالها در آبهاي آلوده، خاک مرطوب و لايههاي زيرين خاک (زير 75 سانتيمتر) زنده بماند. فاکتورهاي بيولوژيکي (نظير ميکرواورگانيسمهاي آنتاگونيست) و محيطي (عمدتاً دما و رطوبت خاک) قادرند بقاي باکتري را در خاک و محيط آبي تحت تأثير قرار دهند. جمعيت باکتري در دماي پايين (زير 4 درجه سانتيگراد) سريعاً کاهش مييابد اما باکتري در اين حالت قادر است به صورت غير قابل کشت اما پايدار باقي بماند. در زيستگاههاي طبيعي باکتري قادر است زمستانهاي نسبتاً گرم را در علفهاي هرز يا رايزوسفر گياهان غير ميزبان که منبع اينوکولوم محسوب ميشوند، باقي بماند. طغيانهاي اخيربيماري پوسيدگي قهوهايدر انگلستان به گياه نيمه آبزي Solanum dulcamara که آلوده به R. solanacearum بود، نسبت داده ميشود. باکتري از ريشههاي اين گياه وارد آب مورد استفاده براي آبياري گياه سيبزميني ميشود. به دليل خروج فراوان باکتري از ريشه شمعدانيهاي داراي آلودگي پنهان، استفاده از سيستمهاي آبياري موجي در توليدات گلخانهاي براي انتشار باکتري راه مناسبي است و خطر گسترش آن را از گياهي به گياه ديگر افزايش ميدهد (سوانسون و همکاران، 2005). 1-1-8- تشخيص و شناسايي باکتري R. solanacearum تراوش باکتري يک علامت معمول تشخيص بيماري است (آلن و همکاران، 2001). اگر ساقه بريده شده گياه آلوده درون آب قرار داده شود، يک لعاب کشدار سفيد رنگ در عرض 15 دقيقه، از انتهاي ساقه بريده خارج ميشود. اين رشتهها تراوش (اوز) باکتري هستند که از آوندهاي چوبي آلوده خارج ميشوند. اين آزمايش يک ابزار تشخيصي معتبر براي تشخيص بيماري در مزرعه است. به همين ترتيب ممکن است اوز باکتري از غده بريده شده هم خارج شود. باکتري R. solanacearumبه دنبال جداسازي از گياهان بدون علامت يا داراي علامت و همچنين آب يا خاک، توسط چندين روش مولکولي و ميکروبيولوژيکي قابل شناسايي است (پريو[60] و همکاران، 2006؛ شاد و همکاران، 2001؛ ولر[61] و همکاران،2000). ترکيب حداقل دو روش تکميل کننده متفاوت براي شناسايي بدون ابهام گونهها و بيووارها ضروري است. تستهاي غربالگري ميتوانند تشخيص زود هنگام باکتري را در گياه يا آب و خاک آلوده راحت کنند، اما در مورد شناسايي نژاد و بيووار کارايي لازم را ندارند. اين تستها شامل تراوش باکتري، کشت روي محيطهاي نيمه انتخابي مثل محيط SMSA تغيير يافته (الفينستون و همکاران، 1996)، استفاده از آنتيباديهاي اختصاصي گونه، ELISA، PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي گونه (rRNAS16)، IFAS[62]، FISH[63] (والينگز[64] و همکاران، 1998) و آزمون بيماريزايي با استفاده از ميزبان حساس، نظير گياهچه گوجهفرنگي جهت اثبات نتيجه مثبت IFAS، آناليز اسيدهاي چرب و پروتئينها و RFLP هستند (الفينستون و همکاران، 1996؛ شاد و همکاران، 2001؛ ولر و همکاران،2000). طبق گزارش فوک ويک[65] و همکاران در سال 2006، روش PCR-RFLP با استفاده از آغازگرهاي ژن hrp براي شناسايي استرينهاي R. solanacearum بسيار معتبرتر از آغازگرهاي OLI1-Y2 است. ايمونواستريپهايي (Agdia or CLS Pocket Diagnostics) به صورت تجاري موجود هستند که ميتوان از آنها براي تشخيص سريع باکتري در مزرعه يا آزمايشگاه استفاده کرد. تست بيووار، آزمايشي است بر پايه توانايي استرينهاي باکتري در توليد اسيد از تعدادي ديساکاريد و الکلهاي قندي که نيازمند محيط کشت خاص و صرف زمان زيادي است (هيوارد، 1964؛ شاد و همکاران، 2001). حساسيت رديابي باکتري R. solanacearum در خاک با به کارگيري محيط کشت SMSA بيش از محيط کشتهاي TTC و SM-1 بوده است. به اين ترتيب محيط کشت مذکور داراي بالاترين راندمان در رديابي کلاسيک باکتري در غده سيبزميني و خاک ميباشد به طوري که قادر است جمعيتهاي کمتر از 102 سلول در هر گرم خاک را در مزارع آلوده شناسايي کند (رزمي و همکاران، 1383). 1-1-9- راههاي پراکنش باکتري R. solanacearum گسترش طبيعي اکثر نژادهاي باکتري خيلي محدود و آهسته است. با وجود اين نژاد 2 (عامل بيماري موکوي موز) قادر است توسط حشرات منتقل شود و پتانسيل طبيعي بالايي از لحاظ گسترش دارد. نژاد 3 با خروج از ريشههاي شناور S. dulcamara به راحتي توسط آبهاي سطحي منتقل ميشود و ديگر ميزبانها را نيز آلوده ميسازد (اولسون[66]، 1976). راه اصلي گسترش بيماري در سطح وسيع و بينالمللي، سيبزميني هاي بذري و يا ديگر اندامهاي تکثيري داراي آلودگي پنهان هستند. آلودگي طبيعي بذر حقيقي تنها در مورد بادامزميني گزارش شده است. به دليل شرايط آب و هوايي نامناسب، ارقام نسبتاً مقاوم و توان بيماريزايي کم برخي از استرينها، غدههاي سيبزميني داراي آلودگي پنهان هستند و مهمترين عامل ورود بيمارگر به مناطق جديد به حساب ميآيند. 1-1-10- اهميت اقتصادي بيماري پژمردگي باکتريايي سيبزميني باکتريR. solanacearumمانع جدي براي کشت گياهان سولاناسه در مناطق گرمسيري و معتدل به حساب ميآيد. بيشترين خسارت اقتصادي از روي سيبزميني، توتون و گوجهفرنگي از امريکاي جنوبشرقي، اندونزي، برزيل، کلمبيا و افريقاي جنوبي گزارش شده است. متوسط خسارت باکتري در بين سالهاي 1966 تا 1968 در فيليپين حدود 15% روي گوجهفرنگي، 10% در بادمجان و فلفل و 5-2 درصد در توتون بوده است (زهر[67]، 1969). در حوزه آمازون در پرو حدود نيمي از مزارع موز مورد حمله باکتري قرار گرفتند و گسترش سريع بيمارگر باعث تخريب مزارع در سراسر جنگل پرويان شد (فرنچ[68] و سکويرا، 1968). در هند گاهي خسارات کلي به گياه گوجهفرنگي وارد ميشود. با طغيان بيماري در اسرائيل به دليل بالا بودن درجه حرارت در مرحلهاي که گياه جوان است، خسارت وارد آمده به سيبزميني بهاره بيش از سيبزميني پائيزه گزارش شد (ولکاني و پالتي[69]، 1960). همچنين خسارات قابل توجهي در سيبزميني طي سالهاي 1953-1951 در گريک گزارش شده است (زاکوس[70]، 1957). اين باکتري حداقل 7/3ميليون جريب از اراضي زير کشت سيبزميني را در بيش از 80 کشور آلوده ميکند و خسارت ساليانه آن در حدود 950 ميليون دلار است (DEFRA[71]، a2003). طغيانهاي غيردائم اما با تعداد رو به افزايش از سال 1972 در اروپا به دليل شدت بيماري و همچنين انجام اقدامات قرنطينهاي مبني بر انهدام گياهان بيمار و زمينهاي آلوده، باعث ايجاد خسارات قابل توجهي شده است (الفينستون، 1996؛ جينز[72]، 1996). در فلوريدا نژاد يک باعث ايجاد خسارت روي گوجهفرنگي است (مامال[73] و همکاران، 2003). اثر نژاد 3 روي گوجهفرنگي و ديگر محصولات در ايالات متحده هنوز ناشناخته است. نژاد 3، بيووار 2 باکتري R. solanacearum باعث مرگ و مير گياه شمعداني ميشود اما Xanthomonas pelargonii از اهميت بيشتري براي کشاورزان برخوردار است (دانکل، 2007). 1-1-11- ميزبانهاي باکتري R. solanacearum به استثناي A. tumefaciens هيچ بيمارگر گياهي ديگري مثل R. solanacearum گونههاي زيادي از گياهان را مورد حمله قرار نميدهد (کلمن، 1953). کلمن گياهان حساس به بيماري را به دو گروه تقسيم کرده است. گروه يک شامل آنهايي است که ميزبان واقعي باکتري هستند و يا يکي از چند ويژگي زير را دارا ميباشند: 1- حساسيت در شرايط طبيعي 2- حساسيت به آلودگي در شرايط طبيعي و تلقيح مصنوعي و 3- حساسيت شديد به آلودگي با تلقيح مصنوعي. گروه دو شامل گياهاني ميشود که ميزبان واقعي باکتري نيستند (هيوارد، 1994). به گزارش کلمن، 33 خانواده در گروه يک قرار ميگيرند. با مطالعات صورت گرفته از دهه 1950 تا سال1990 بيست خانواده ديگر نيز شناسايي شدهاند که ميزبان اين باکتري هستند. بيش از 270 گونه گياهي، اعم از گياهان تکلپه و دولپه متعلق به حدود 50 خانواده مورد حمله اين باکتري قرار ميگيرند (هيوارد، 1994 و 1995). در بين دولپهايها، بيشترين تعداد ميزبانها به ترتيب متعلق به خانوادههاي Solanaceae ، Asteraceae و Leguminoseae هستند و در ساير خانوادهها ممکن است تنها يک يا چند گونه به عنوان ميزبان وجود داشته باشند. از گياهان متعلق به رده تکلپهايها تنها 9 تا 3/9 درصد به عنوان ميزبان اين باکتري گزارش شدهاند که متعلق به خانوادههاي Musaceae، Strelitziaceae، Heliconiaceae، Cannaceae و Zingiberaceae هستند (بردبري[74]، 1986، هيوارد، 1994 و 1995). از جمله ميزبانها ميتوان به سيبزميني، گوجهفرنگي، بادمجان، توتون، زنجبيل، بادامزميني، موز، پياز، خيار، توتفرنگي، شمعداني، کتان، تربچه، توت، کاساوا و بسياري از گياهان ديگر از خانوادههاي Solanaceae،Cucurbitaceae، Geraniaceae، Rosaceae، Robiaceae، Araceae، Alliaceae، Heliconiaceae، Brasicaceae،Oxalidaceae و... اشاره کرد (هيوارد، 1994). همچنين بسياري از علفهاي هرز نيز ميزبان اين باکتري هستند و بنابراين پتانسيل R. solanacearum براي ايجاد اينوکولوم افزايش مييابد. نژاد يک باکتري R. solanacearum درمناطق گرمسيري در سرتاسر جهان وجود دارد، توتون و بسياري از گياهان خانواده سولاناسه و همچنين بسياري از گياهان موجود در ديگر خانوادههاي گياهي را مورد حمله قرار ميدهد و دماي بهينه بالايي دارد (35 درجه سانتيگراد). نژاد دو عمدتاً در مناطق گرمسيري امريکاي جنوبي وجود دارد و به موز و Heliconia حمله ميکند (بيماري موکوي[75] موز) و در فيليپين بيماري باگتاک[76] بارهنگ را ايجاد ميکند. نژاد سه در عرضهاي جغرافيايي بالاتر و مناطق گرمسيري و نيمه گرمسيري و معتدل وجود دارد و سيبزميني، گوجهفرنگي، گاهي شمعدانی، بادمجان و کيسه کشيش، بعضي از علف هاي هرز خانواده سولاناسه نظير تاجريزي سياه و S. dulcamara را مورد حمله قرار ميدهد. اين نژاد دماي بهينه پايينتري دارد (27 درجه سانتيگراد) و به نظر ميرسد شامل بيووار A2 و گروه RFLP 26 با گسترش جهاني (کوک و سکويرا، 1994)، بيووار A2 و گروه RFLP 27 (موجود در شيلي و کلمبيا) يا بيووار T2 (گاهي بيووار N2 هم ناميده ميشود و در نواحي گرمسيري امريکاي جنوبي وجود دارد) باشد. نژاد چهار زنجبيل و نژاد پنج توت را آلوده ميکند. 1-1-12- مديريت بيماري پژمردگي باکتريايي سيبزميني کنترل پژمردگي باکتريايي کار مشکلي است. مقاومت افقي متوسط (ارقام متحمل) نسبت به استرينهاي R. solanacearum در سيبزميني و گوجهفرنگي گزارش شده اما آزمايشات کمي مبني بر مقاومت گوجهفرنگي به پژمردگي مربوط به استرينهاي نژاد 3، بيووار 2 وجود دارد (بوشو[77]، 2005). برخي از گزارشات حاکي از آن هستند که ارقام مقاوم به پژمردگي باکتريايي در گوجهفرنگي و لاينهاي اصلاح شده، مقاومت ضعيفي نسبت به نژاد 3، بيووار 2 از خود نشان ميدهند (چامپويزو و همکاران، 2009). از آنجائيکه مقاومت در مناطق مختلف به دليل تفاوت استرينها تفاوت دارد، مقاومت ميزباني براي کنترل پژمردگي باکتريايي در سيبزميني و گوجهفرنگي زياد مؤثر نميباشد (هانسون[78] و همکاران، 1996؛ پرادهانانگ[79] و همکاران، 2000). مقاومت در سيبزميني در دماي بالا اغلب موفق نيست. پيوند گوجهفرنگيهاي حساس به گوجهفرنگيهاي مقاوم يا ديگر گياهان خانواده سولاناسه در مقياس تجاري در ژاپن، بنگلادش و فيليپين صورت گرفته است اما در مورد نژاد 3، بيووار 2 امتحان نشده است. طبق گزارش اسکات[80] وهمکاران (2005) منابع مقاومت در گوجهفرنگي شناسايي شده و ارقام مختلف و با سطوح متفاوت مقاومت، ايجاد شدهاند. مقاومت ارقام مختلف سيبزميني نسبت به استرينها و بيووارهاي مختلف نژاد 1 باکتري با روشهاي گوناگون مورد بررسي قرار گرفته است اما تعداد کمي از ارقام مقاومت نشان دادهاند (جاورسکي[81] و همکاران، 1987؛ گنزالس و سامرز[82]، 1996). هانگ هاي[83] و همکاران (2008) مقاومت ژرمپلاسم گوجهفرنگي وحشي را نسبت به استرينهاي مختلف نژاد يک باکتري مورد بررسي قرار دادند. نتايج حاکي از اين بود که اکثريت آنها، به استثناي تعداد کمي از S. pennelli و S. chmielewskii که درصد گياهان پژمرده در آنها مساوي يا کمتر از 60% بود، حساسيت بالايي به بيماري دارند. با بررسيهاي بيشتر و استفاده از دو استرين ديگر عليه لاينهاي مقاوم مشخص شد که در اين گياهان مقاومت اختصاصي نژاد وجود دارد. باقري و تقوي (1379) مقاومت تعدادي از ارقام سيبزميني و گوجهفرنگي را نسبت به بيماري پژمردگي باکتريايي مورد بررسي قرار دادند. بر اين اساس، رقم گرانولا حساسترين و ارقام فرسيا، ديامانت و مونديال نسبتاً مقاوم بودند و در گوجهفرنگي رقم L-612 حساس و رقم L-528 نسبتاً مقاوم گزارش شدند. به دليل عدم کارايي و امکان استفاده از سموم شيميايي در کنترل بيماري، استفاده از ارقام مقاوم و متحمل يکي از روشهاي مهم کاهش خسارت و پيشگيري از اين بيماري ميباشد. طي يک آزمايش، مقاومت نسبي 19 رقم تجاري سيبزميني بررسي و مشخص شد که هيچيک از ارقام در برابر بيماري مقاوم نيستند اما ارقام سانتا، آئولا، مارفونا، کوزيما و آگريا بالاترين ميزان تحمل و ارقام ديامانت و پريمر بيشترين ميزان حساسيت را نسبت به ساير ارقام از خود نشان دادند (آزادوار و همکاران، 1383). ارقام کاملاً مقاوم سيبزميني هنوز به صورت تجاري موجود نيستند (زيمناکگازوسکا[84] و همکاران، 2005). اکثر ارقامي که مقاومت نسبي نشان ميدهند، به نظر ميرسد که متحمل به بيماري باشند. ميزان اين تحمل تحت تأثير شرايط محيطي است (بوشو، 2004) که از جمله اين شرايط ميتوان به دماي بالا (فرنچ و دليندو[85]، 1982)، شدت نور کم و فتوپريود کوتاه (سکويرا و راو[86]، 1969) اشاره کرد. کنترل شيميايي بيماري پژمردگي باکتريايي هم تقريباً غير ممکن است. بخاردهي خاک يا استفاده از آنتيبيوتيکها از نظر زيست محيطي مخرب و گران است و اثري روي پژمردگي باکتريايي ندارد (سادلر[87]، 2005؛ موراکوشي و تاکاهاشي[88]، 1984؛ فاراگ[89] و همکاران، 1982). بنابراين، اقدامات کنترلي در مزرعه شامل استفاده از غدههای سالم و عاری از آلودگی برای کشت، رعايت بهداشت گياهي و به کارگيري روشهاي زراعي است. در مناطقي که بيمارگر درآنجا استقرار يافته است، اقدامات زراعي تحت بعضي شرايط ميتواند مؤثر واقع شود. اين اقدامات شامل تناوب با گياهان غير ميزبان مثل گراسها، کشت مخلوط، کنترل علفهاي هرز و نماتد عامل زخم ريشه، کاشت در نواحي عاري از آلودگي، انهدام بقاياي گياهي و علفهاي هرز که منبع اينوکولوم هستند، انتخاب زمان مناسب کاشت به منظور فرار از گرما، شخم عميق بقاياي گياهي، زهکشي مناسب خاک و مديريت آبياري در ابتدا و انتهاي فصل ميباشند (هيوارد، 1991؛ سادلر، 2005). کشت مخلوط سيبزميني و ذرت يا لوبيا در برخي موارد ميزان اينوکولوم و توسعه بيماري را کاهش داده (آتريک و پاتس[90]، 1987) اما در جاهايي که باکتري توانسته زنده بماند، لکههايي ايجاد شده است (گرانادا[91] و سکويرا، 1983). بريدن غدهها باعث افزايش شدت بيماري به ميزان 5/2 برابر و کاهش عملکرد به ميزان بيش از 40% ميشود (ويجاياکومار[92] و همکاران، 1985). تناوب زراعي به مدت 7 - 5 سال و بدون کاشت گياهان حساس و همچنين کاربرد حاصلخيز کنندهها به منظور تغيير pH خاک توصيه مناسبي است. در امريکا با پايين آمدن pH تا 5 - 4 در تابستان و 6 در زمستان باکتري از بين ميرود. اين بيماري در خاکهاي شني، لومي، رسي و پيت شديد است اما در خاکهاي آهکي اصلاً ديده نميشود. بنابر يافتههاي سمواتيان و همکاران (1383) تناوب چهار ساله سيبزميني- اسپرس- اسپرس- سيبزميني باعث کاهش درصد بوتههاي پژمرده به ميزان 07/29% نسبت به سال اول تناوب شده است. بقاياي گياهي، غدههاي داراي آلودگي پنهان و لايههاي عميق خاک براي بقاء باکتري مناسب هستند (گراهام و لويد[93]، 1979، گراهام و همکاران، 1979). اگرچه گزارشاتي مبني بر عدم بقاء طولاني مدت باکتري در خاک وجود دارد (الفينستون، 1996؛ گراهام و همکاران، 1979) از سودان، فرانسه، انگلستان و هلند گزارش شده که باکتري قادر است در خاک، جوي آب و يا ريشه گياهان علفي مثل S. dulcamara، زمستانگذراني کند (الفينستون و همکاران، 1998؛ ونالساس و همکاران، 2000؛ اولسون، 1976). طبق گزارش شکاوات[94] و همکاران (1991) مدت زمان بين خروج باکتري از غده آلوده تا از بين رفتن آن در برخي از خاکها هشت ماه گزارش شده است. با وجود اين، R. solanacearum در خاکهاي عاري از گياه در شرايط معتدل زنده ميماند (شمسالدين[95] و همکاران، 1979). بنا بر گزارش گراهام و همکاران در سال 1979، در سيبزمينيهاي کشت شده در زميني که چهار سال زير کشت سيبزميني نرفته بود پژمردگي ايجاد شد که نشاندهنده بقاء باکتري به مدت چهار سال در اين زمين است. علاوه بر اين گراهام و لويد (1979) اظهار داشتند که بقاء نژاد 3 باکتري در لايههاي عميقتر خاک به دليل تغييرات حرارتي کمتر، احتمال پايين شکار شدن توسط پروتوزوآها يا رقابت و آنتاگونيسم کمتر، بيشتر است. کاربرد مواد شيميايي و اصلاح خاک نظير تغيير pH، آفتابدهي و کاربرد پودرهاي شستشوي پايدار و همچنين القاء کنندههاي مقاومت در گياه (acibenzolar-S-methyl)، روغنهاي گياهي (تيمول) يا اسيد فسفريک جمعيت باکتري و شدت بيماري را در مقياس کوچک کاهش دادهاند (آنيت[96] و همکاران، 2004؛ جاي[97] و همکاران؛ 2005، نورمن[98] و همکاران، 2006؛ سادلر، 2005). ايرادهاي عمده وارد آمده به اين روشها شامل خسارات زيستمحيطي، هزينه و دستمزد بالا است. اثر بخشي اين راهکارها بايد از لحاظ تجاري مورد تأييد قرار گيرد و نکته قابل ذکر ديگر اين است که اکثر اينها عليه استرينهاي نژاد 3، بيووار 2 به کار گرفته نشدهاند. استفاده از روغنهاي جدا شده از گياهان مختلف (تيمول و پالماروزا، تايم، مارجورام و اورگانو) جمعيت باکتري را در شرايط آزمايشگاهي و شدت پژمردگي باکتريايي را در گلخانه روي گوجهفرنگي به صورت مؤثري کاهش داده است (پرادهانانگ و همکاران، 2003). کنترل بيولوژيکي بر پايه خاکهاي بازدارنده يا استرينهاي آنتاگونيست نيز در سطح کوچک نتايجي را در بر داشته اما بايد در سطح وسيعتر و عليه نژاد 3، بيووار 2 کارايي خود را اثبات کند (سادلر، 2005). در مناطقي که بيمارگر وجود دارد اما هنوز مستقر نشده است، رعايت بهداشت زراعي به منظور سالم نگه داشتن مناطق غيرآلوده ضروري به نظر ميرسد. اقدامات زراعي شامل کاشت غدهها و قلمههاي گواهي شده و عاري از بيماري، ضدعفوني و تمييز کردن تجهيزات قبل از ورود به زمين، کنترل جريان آبهاي سطحي (سيلابها) و عدم استفاده از آبهاي سطحي براي آبياري ميباشد. حتي در مناطقي که باکتري در خاک وجود دارد استفاده از غدههاي بذري عاري از آلودگي شدت بيماري را به ميزان قابل توجهي کاهش داده و به کشاورزان اجازه برداشت محصول بهتر را ميدهد. در مناطقي که اثري از وجود باکتري ديده نميشود، بهترين و اولين اقدام جلوگيري از ورود باکتري و در صورت ورود جلوگيري از گسترش آن است (چامپويزو و همکاران، 2009) 1-2- قارچColletotrichum coccodes 1-2-1- مقدمه گونههاي Colletotrichum و تلئومورف آن Glomerella، در مناطق معتدل و گرمسيري شايع هستند و يکي از مهمترين گروههاي قارچهاي بيمارگر گياهي ميباشند. بسياري از گونههاي Colletotrichum (حدود 40 گونه) باعث ايجاد آنتراکنوز روي ساقه، برگ و ميوه تعداد زيادي از گياهان داراي اهميت اقتصادي نظير غلات، گراسها، لگومينوزها، ميوهها و سبزيجات و انواع گياهان علفي ميشوند (داکن[99]، 2007). تعريف گونه در اين جنس بر اساس شكل ظاهري قارچ روي مواد طبيعي در درجه اول، و در درجه دوم اهميت بر اساس شكل قارچ در محيط كشت است. گاهي اوقات وجود يا عدم وجود اختصاص ميزباني نيز مورد توجه قرار مي گيرد. اين موضوع باعث ايجاد مشكلات متعددي در شناسايي شده است، كه براي تبادل دقيق اطلاعات يك عامل اساسي است (ساتن[100]، 1992). جنس Colletotrichum متعلق به گروهي از قارچها است که به عنوان Coelomycetes شناخته ميشوند و يک شبه رده از قارچهاي ناقص هستند. سلوميستها اسپورهاي غيرجنسي (کنيديوم) توليد ميکنند که در اندامکهاي تخصص يافته که معمولاً به شکل پيکنيد يا آسروول هستند ايجاد ميشوند. آسروول شامل يک سري هيفهاي بارور است که در سطح کنيديماتا قرار دارد و هيفهاي تيره رنگ با ديواره ضخيم و عقيمي به نام مو يا ستا[101] به آن متصل هستند. آسروولهاي توليد شده ديسک شکل، مومي و زيراپيدرمي هستند (بايلي[102] و همکاران، 1992؛ بارنت و هانتر[103]، 1998؛ کانو[104] و همکاران، 2004). در طي آلودگي و با بالغ شدن لکههاي حاصل از بيماري، آسروولها در لايههاي خارجي ميزبان تشکيل ميشوند و نهايتاً کنيديفورها در سطح آنها ايجاد ميگردند (اسکيپ[105] و همکاران، 1995). کنيديفورها ساده و کشيده هستند، کنيديومها شفاف، يک سلولي، دوکي و کشيده تا هلالي شکل ميباشند (بارنت و هانتر، 1998). بر اساس ويژگيهاي کنيديوم، گونههاي Colletotrichum اغلب به دو گروه تقسيم ميشوند: گروه اول داراي کنيديومهاي صاف و مستقيم و گروه دوم داراي کنيديومهاي هلالي هستند (اسکيپ و همکاران، 1995). جوانهزني کنيديوم اوليه ممکن است منجر به توليد يک کنيديوم ثانويه شود که معمولاً اندازه کوچکتري دارد و خصوصاً در کشتهاي قديمي شکل ثابتي ندارد (کانون[106] و همکاران، 2000). کنيديومها معمولاً به شکل تودهاي و مجتمع در داخل لعابي حاوي گليکوپروتئينها، پليساکاريدها، آنزيمها و ديگر مواد تشکيل ميشوند (بايلي و همکاران، 1992؛ جميل و نيکولسون[107]، 1989؛ اسکيپ و همکاران، 1995). نقش اين لعاب حفظ بقاء کنيديوم در شرايط کمبود رطوبت و جلوگيري از جوانهزني زودرس آن در زمان پراکنش اينوکولوم ميباشد (بايلي و همکاران، 1992). توليد مثل جنسي اصلاً و يا به ندرت ايجاد ميشود (کانون و همکاران، 2000) و در صورت وجود، فرم جنسي آن Glomerella است که در گروه قارچهاي آسکوميست قرار ميگيرد. 1-2-2- خصوصيات قارچ عامل بيماري خال سياه سيبزميني خال سياه بيماري است که باعث ايجاد خسارت و لکه روي غده و شاخ و برگ گياه سيبزميني شده و توسط قارچ C. coccodes ايجاد ميشود. کنيديومهاي C. coccodes سيلندري شکل با انتهاي باريک، شفاف و بدون ديواره بوده و اندازه آنها بين 5/4-5/2 * 24-16 ميکرومتر ميباشد و در تودههاي نارنجي تا عنابي رنگ و لزج تشکيل ميشوند (ساتن، 1992). پرگنهها در محيطهاي مختلف به صورت ميسليومهاي هوايي سفيد رنگ هستند. آسروولها روي اندامهاي مختلف گياه مثل ساقه، ريشه و ميوهها ديده ميشوند. ميکرواسکلروتها گرد تا کشيده با قطر حدود 300-200 ميکرومتر ميباشند و کنيديفورهاي ديوارهدار و شاخهاي توليد ميکنند (مکاينتاير و روزانوفسکي[108]، 1975). ميکرواسکلروتها از توسعه آسروول ايجاد شده و به فراواني روي سطح محيط کشت و بافت ميزبان وجود دارند (ديويس و جانسون[109]، 2002) و به مدت يک سال يا بيشتر در خاک دوام ميآورند (فارلي[110]، 1976). C. coccodes از نظر ظاهري داراي تنوع ميباشد، به اين ترتيب که اندازه ميکرواسکلروت، رنگ، ميسليوم هوايي و فراواني تشکيل سکتور در جدايههاي مختلف تفاوت ميکند (چسترز و هورنباي[111]، 1965، کام و استيونسون[112]، 1978). برخي از جدايهها ممکن است به صورت تيپيک ميکرواسکلروت توليد نکنند و حتي در بعضي موارد اصلاً ميکرواسکلروتي توليد نميشود (بارکدول[113] و ديويس، 1992). بيشترين ميزان جوانهزني کنيديوم در دماي22 درجه سانتيگراد صورت ميگيرد. هيچيک از کنيديومها در دماي 7 درجه سانتيگراد قادر به جوانهزني نميباشند و کمتر از 70% آنها در دماي 10 درجه سانتيگراد يا 31 درجه سانتيگراد جوانه ميزنند. ميزان رشد پرگنه در دماي 31 - 25 درجه سانتيگراد بيشتر است و شرايط بهينه، دماي 28 درجه و 6 pH: ميباشد (ديلارد[114]، 1988). 1-2-3- تاريخچه بيماري خال سياه سيب زميني در ايران و جهان قارچ عامل بيماري اولين بار در سال 1908 در مدرسه ملي كشاورزي برن توسط داكومت[115] شناخته شد (ظفري، 1370). گزارشات اوليه مبني بر وجود اين بيماري در سيبزميني و گوجهفرنگي به اوائل قرن نوزدهم برميگردد و جزئيات بيماري درآن زمان توسط ديکسون[116] (1926) شرح داده شد. اين گزارشات بيماري خال سياه را يک مشکل جدي در سيبزميني نميدانستند. اين قارچ بعدها توسط چسترز و هورنباي (a1965) به عنوان يک بيمارگر شايع اما داراي اهميت اقتصادي کم در سيبزميني و توسط زيتر[117] و همکاران (1989) به عنوان يک بيمارگر ضعيف در ريشه گوجهفرنگي مطرح شد. با وجود اين، تعداد گزارشات مبني بر شدت و خسارت بيماري در حال افزايش ميباشد (موهان[118] و ديويس، 1987؛ بارکدول و ديويس، 1992؛ ديلارد، 1992؛ جانسون و ميليزکي، b1993؛ جانسون، 1994؛ تسرور (لاهکيم) و همکاران، 1994 و b1999؛ ريد و هايد، a1995؛ اندريون و همکاران، 1997). بيماري خال سياه سيبزميني و عامل آن، اولين بار در ايران در سال 1334 از باسمنج تبريز توسط شريف جمع آوري و شناسايي شد. در سال 1343 نيمان، کارشناس آلماني وزارت کشاورزي، در اقليد فارس از سيب زميني هايي که دچار بوته ميري شده بودند، قارچ C. coccodesرا جدا و گزارش نمود. اماني (1343) و کريمي (1349) اين بيماري را مورد بررسي قرار داده و علت بوته ميري را به C. coccodes نسبت دادند. بهروزين (1359 تا 1364) اين بيماري را در استان آذربايجان شرقي و اردبيل مورد بررسي قرار داده و از بوته هاي سيبزميني که دچار بوته ميري شده بودند، قارچ C. coccodes را جدا و اثبات بيماريزايي کرده است. ظفري (1370) اثر آنتاگونيستي قارچ تريكودرمارا روي اين قارچ بررسي کرده و بيان نموده است که موضوع قابل توجه در مورد اثبات بيماريزايي C. coccodesبه وجود آوردن خشکي براي حمله و تسريع علائم مي باشد و تنش هاي آبي يکي از عوامل مؤثر در پيشرفت بيماري خال سياه به شمار مي رود. همچنين بيان کرده است که شدت بيماريزايي در شرايط خشکي توسط C. coccodesرا شايد بتوان تا حدودي در اثر کاهش فعاليت آنتاگونيست هاي اين قارچ از جمله تريکودرماهاي موجود در خاک دانست (طراح، 1385). 1-2-4- موقعيت تاکسونوميک C. coccodes
در طبقه بندي هاي جديدتر (الكسوپولوس[124] و همكاران، 1996؛ سيفرت و گمز[125]، 2001)، قارچ هاي ناقص بر اساس مرحله تلئومورفي خود دسته بندي مي شوند. به اين ترتيب Colletotrichum در گروه آنامورف هاي راسته فيلاكورال ها[126] قرار مي گيرد. ونآرکس[127] در سال 1957 تعداد 750 گونه Colletotrichum را بر اساس مورفولوژي در 11 تاکسون قرار داد. بر اساس مطالعات دقيقتر صورت گرفته پيرامون مورفولوژي، ويژگيهاي رشدي و بيماريزايي، تعداد گونههاي پذيرفته شده به 39 عدد رسيده است (ساتن، 1980، 1992). ساتن (1992) بسياري از تاکسونهايي را که توسط ونآرکس فرم اختصاصي معرفي شده بودند را به صورت گونههاي مستقل معرفي کرد. به عنوان مثال، ساتن C. circinans را گونهاي مستقل از C. coccodes و ساير گونههاي Colletotrichum معرفي کرد در حاليکه ونآرکس C. circinans را فرم اختصاصي از C. dematium ميدانست که روي جنس Allium ايجاد بيماري ميکرد. از آناليز ناحيه ITS نيز مانند نواحيD1 و D2 در rDNA هستهاي، به ميزان زيادي در حل مسائل مربوط به تاکسونومي Colletotrichum استفاده شده است (سرينيواساپراساد[128] و همکاران، 1996؛ فيريمن[129] و همکاران، 2000). مارتين و گارسيافيگرز[130] (1999) و آبانگ[131] و همکاران (2002) نتوانستند بر اساس توالي ناحيه ITS، C. coccodes را از C. circinans تشخيص دهند. آنها اين نظريه را ارائه دادند که بر خلاف تفاوت ظاهري و مورفولوژيکي، اين دو گونه يکسان هستند و به يک تاکسون تعلق دارند. از مارکرDGGE براي بررسي rDNA و شرح گونه در جنسهاي مختلف قارچها نظير Pleomassaria و Melampsoridium استفاده شده است (پاوولينن[132] و همکاران، 2000). همچنين آناليز ناحيه 18S rDNA با استفاده از DGGE براي تعيين تفاوت مولکولي بين C. gloeosporioides و C. acutatum نتايج موفقيتآميزي به همراه داشت (فاگبولا[133] و همکاران، 2001). در يک تحقيق ديگر، فاگبولا و آبانگ (2004) از DGGE براي بررسي ناحيه 18S rDNA دو گونه C. coccodes و C. circinans استفاده و تفاوت بين اين دو را نشان دادند. در بسياري از مطالعات مولکولي از RFLP، بررسي توالي rDNA و RAPD به منظور مشخص کردن سيستماتيک C. coccodes استفاده شده است. انگشتنگاري DNA با نشانگر RAPD و استفاده از 4 پرايمر، تفاوت قابل اطميناني را بين 10 گونه Colletotrichum نشان داد (فيريمن و همکاران، 1993). گونههاي جديد بر اساس توالي ناحيه rDNA در جنس Colletotrichum قرار گرفتهاند و رابطه روشني بين مشاهدات مورفولوژيکي و مولکولي وجود دارد( شريف[134] و همکاران، 1994). 1-2-5- آلودگي و توسعه علائم اكثر گونه هاي Colletotrichum داراي روش كلونيزه كردن درون سلولي هستند. در اين گونه ها ميسليومها بعد از نفوذ، بدون اين كه درون پروتوپلاست نفوذ كنند، بين غشاء پلاسمايي و ديواره سلولي رشد مي كنند. به اين ميسليومها ، ميسليومهاي درون سلولي گفته مي شود كه بيوتروف هستند و بعد از كلونيزه كردن يك يا چند سلول ميزبان، ميسليومهای ثانويه نكروتروف را به وجود مي آورند (اوكانل[135] و همكاران، 1985؛ بايلي و همكاران، 1992؛ لاتوند-دادا[136] و همكاران، 1996). اين قارچ ها كه در ابتدا و قبل از اين كه به نكروتروفي تغيير وضعيت دهند، روي سلول هاي زنده ميزبان زندگي مي كنند، به عنوان قارچ هاي همي بيوتروف[137] يا بيوتروف هاي اختياري شناخته مي شوند. طول دوره بيوتروفيك در گونه هاي مختلف Colletotrichum متغير است. در طول مراحل اوليه كلونيزه كردن داخلي، چه در حالت بيوتروفيك و چه همي بيوتروفيك، گياه ميزبان، بيمارگر را شناسايي نمي كند و هيچ پاسخ دفاعي خاصي وجود ندارد (لاتونددادا و همكاران، 1996). همه اندامهاي زيرزميني سيبزميني نسبت به آلودگي به C. coccodes حساس هستند (داکومت[138]، 1908؛ اشميتنخت[139]، 1956). گزارشات اوليه مبني بر آلودگي ريشهها، استولونها، ساقهها و غدههاي دختري از طريق رشد داخلي ميسليوم است که اين آلودگي ناشي از غدههاي آلوده و يا تماس قسمتهاي سالم گياه با بقاياي گياهي آلوده ميباشد (داکومت، 1908). با کاشت غدههاي آلوده در گلخانه، علائم اوليه بيماري روي ريشهها، استولونها و ساقهها به ترتيب پس از گذشت 2، 8 و 8 هفته قابل مشاهده هستند (اندريون[140] و همکاران، 1998). توسعه سريع علائم روي ريشه ميتواند اين تفکر را ايجاد کند که ريشه محل اوليه آلودگي است (کام و استيونسون، 1978). کاشت غدههاي سالم در خاکهاي آلوده و نيز کاشت غدههاي آلوده در خاک عاري از آلودگي، باعث گسترش سريع آلودگي در اندامهاي زيرزميني سيبزميني ميشود. ساقهها، استولونها و ريشههاي ايجاد شده از غدههاي آلوده پس از کشت سريعاً آلوده شده که به نظر ميرسد به دليل رشد سيستميک قارچ باشد. علائم ناشي از بيماري خال سياه روي ساقهها، استولونها، به ترتيب پس از گذشت 6 و 8 هفته قابل مشاهده ميباشند و شدت علائم روي غدههاي دختري بستگي به زمان بين پير شدن ساقه تا موقع برداشت دارد. آلودگي ميوههاي گوجهفرنگي به وسيله اسپورهاي توليد شده در آسروول آغاز ميشود (فولتون[141]، 1948؛ تو[142]، 1980). شرايط محيطي مناسب براي توسعه بيماري هنوز مشخص نيست اما گسترش وسيع جغرافيايي اين بيماري (مردو[143]، 1967) نشاندهنده اين است که آلودگي مزارع در دامنه وسيعي از شرايط آب و هوايي رخ ميدهد. گزارشات راجع به شرايط محيطي مناسب براي توسعه خال سياه در مزرعه محدود هستند اما با وجود اين شرايط مرطوب خاک براي بيماري مناسبتر است (فيرمن و آلن[144]، 1993؛ هايد و بورر[145]، 1994). C. coccodes در خاکهاي شني سبک با ميزان کم نيتروژن، دماهاي بالا و زهکش ضعيف فراواني بيشتري دارد (استيونسون و همکاران، 1976؛ ديلارد، 1992؛ جانسون و ميليزکي[146]، 1993؛ تسرور و همکاران،b 1999). طبق مطالعات صورت گرفته توسط سانوگ و پنيپاکر[147] (1997) مشخص شد که دما، هوا و نور تأثير قابل توجهي روي جوانهزني ميکرواسکلروتهاي C. coccodes دارند. جوانهزني ميکرواسکلروت به صورت ميسليوم و يا اسپور، تحت شرايط دمايي مختلف اتفاق ميافتد و نسبت به نور و هوا حساستر از دما ميباشد. در شرايط کمبود هوا، ميکرواسکلروت به صورت ميسليوم جوانه زده و در حضور هواي کافي توليد اسپور ميکند. در حضور نور تودههاي اسپور داراي موهاي زيادي هستند و همچنين ميزان CFU بيشتر از تاريکي ميباشد. سانوگ و همکاران در سال 2003 اثر دو عامل فيزيکي مهم، دما و رطوبت، را روي توليد اپرسوريوم قارچ مورد بررسي قرار دادند. به نظر ميرسد که دماي نسبتاً پايين (22 - 16 درجه سانتيگراد) و رطوبت نسبي بالا براي توليد اپرسوريوم مناسبتر باشد. تسرور در سال 2004 اثر طول نور را روي شدت بيماري خال سياه مورد بررسي قرار داد. بر اين اساس مشخص شد که فتوپريود کوتاه به مدت 8 ساعت در مقايسه با فتوپريود بلند به مدت 16 ساعت، ميزان بيماري را افزايش ميدهد. گلايس وارلت[148] و همکاران در سال ۲٠٠۴ رشد C. coccodes در شرايط آزمايشگاهي و قدرت آلودهکنندگي آن را در دماهاي مختلف مورد بررسي قرار دادند و نتيجه گرفتند که قارچ با کمي تفاوت در نحوه و سرعت رشد، قادر است در همه دماهاي مورد آزمايش رشد کند. 1-2-6- علائم بيماري خال سياه خال سياه به ميکرواسکلروتهاي سياه رنگ نقطه مانند و فراوان روي قسمتهاي مختلف گياه اطلاق ميشود. علائم بيماري شامل زردي و پژمردگي شاخ و برگ، پوسيدگي ريشه، ساقههاي زيرزميني و استولونها و در نهايت مرگ سريع گياه ميباشد. اين قارچ قادر به کلونيزه کردن تمام قسمتهاي زيرزميني (غدههاي دختري، ريشهها و استولونها)، قسمت پايين ساقه (اندريون و همکاران، 1997و 1998) و شاخ و برگ (جانسون و ميليزکي، 1993؛ جانسون، 1994؛ موهان و همکاران، 1992) گياه سيبزميني است. علائم اين بيماري ممکن است با علائم ديگر بيمارگرهاي عامل پژمردگي اشتباه گرفته شود. به محض خشک شدن ساقه، ميکرواسکلروتهاي کوچک سياهرنگ در سطح و داخل بافتهاي گياهي پير و مرده، ريشهها و ساقههاي در حال پوسيدن و استولونها و غدههاي دختري ايجاد ميشوند (چسترز و هورنباي، b1965؛ ريد[149] و هايد، 1988). اشميتنخت در سال 1956 بيان کرد که قارچ قادر است ريشهها و استولونها را تا 20 سانتيمتر دورتر از غده مادري کلونيزه کند که در نتيجه ميتوان گفت ريشهها حساسترين اندام به بيماري به شمار ميروند. اين نتايج توسط کام و استيونسون (1978) نيز تأييد شد. آنها بيان کردند که 93% طول سيستم ريشهاي توسط C. coccodes کلونيزه ميشود. علائم روي غده به صورت لکههاي نقرهاي است که ميکرواسکلروتهاي قارچ روي آنها تشکيل شده و باعث بد شکل شدن ظاهر غده ميشود (ديلارد، 1992). در انبار ممکن است اين نقاط خاکستري رنگ شبيه علائم بيماري پوسته نقرهاي ناشي از Helminthosporium solani باشند. به منظور تشخيص اين دو بيماري از هم، لازم است سطح غده با ذرهبين يا ميکروسکوپ براي ديدن ميکرواسکلروتهاي خال سياه و کنيديفورهاي پوستهنقرهاي مورد بررسي قرار گيرد (ارامپالي[150] و همکاران، 2001). اين لکهها معمولاً سطحي هستند اما اگر گسترش يابند غده حالت چروکيده به خود ميگيرد (ريد، 1991). در صورت نگهداري غده آلوده در دماي1- درجه سانتيگراد لکههاي عميق ايجاد ميشوند (پراسکي[151] و همکاران، 2000). ميکرواسکلروتهاي C. coccodes روي سطح ريشه، ساقه و استولونها و معمولاً در ارقام مهم مورد کشت در انگلستان از اواخر خرداد به بعد قابل مشاهده هستند. روي شاخ و برگ علائم به صورت لکههاي آبسوخته است که بعداً به رنگ قهوهاي تيره و سياه درميآيند. ايجاد زخم روي شاخ و برگ توسط خاک جابهجا شده با باد، خصوصاً شن، به ايجاد اين لکهها کمک ميکند. علائم بيماري اغلب تا اواخر فصل قابل مشاهده نيستند و ميکرواسکلروتها بيشتر موقع پيري و مرگ گياه ايجاد ميشوند (جانسون و ميليزکي، 1993؛ موهان و همکاران، 1992). نيتزان[152] و همکاران (2006) کلونيزاسيون گياه سيبزميني را پس از اسپري اسپور روي برگ مورد بررسي قرار دادند. نتايج حاصل هيچ ارتباطي بين رشد C. coccodes و کلونيزاسيون گياه و همچنين شدت توسعه کلروز و نکروز در برگها نشان نداد. 1-2-7- جداسازي، تشخيص و شناسايي قارچ عامل بيماري خال سياه سيبزميني تشخيص C. coccodes در گياه و خاک با استفاده از روشهاي جداسازي معمول و به دنبال آن، شناسايي بر اساس ويژگيهاي ظاهري و تخصص ميزباني صورت ميگيرد (ساتن، 1992). از جمله ويژگيهاي ظاهري ميتوان به رنگ پرگنه، شکل و اندازه کنيديوم، ميکرواسکلروت و اپرسوريوم اشاره کرد. فارلي در سال 1972 يک محيط کشت اختصاصي براي جداسازي C. coccodes از خاک و همچنين براي جداسازي مجدد بيمارگر از خاک آلوده شده به صورت مصنوعي و پوست گوجهفرنگي باقيمانده از سال قبل، پيشنهاد کرد. البته پس از جداسازي قارچ با استفاده از محيط کشتهاي اختصاصي بايد گونه جدايه مورد نظر مشخص شود و همچنين استفاده از محيط کشتهاي اختصاصي، روش کمي مناسبي براي اندازهگيري شدت بيماري نيست و زمانبر است. روي محيط PDA قارچ ابتدا به صورت ميسليومهاي ظريف سفيد رنگ رشد کرده و کنيديفور وکنيديوم روي آنها تشکيل ميشود. رفته رفته ميکرواسکلروتهاي سياه رنگ روي سطح محيط ايجاد شده و در نهايت کل محيط را ميپوشانند. کارنيگ[153] و همکاران (2003)، حساسيت زيستسنجي[154] را در رديابي C. coccodes و H. solani در خاک مورد بررسي قرار دادند. در مورد C. coccodes، تعيين مقدار آلودگي گياه بر اساس ريشههاي آلوده پس از 12 - 9 هفته، يک روش حساس براي تشخيص و کميتسنجي مقدار اينوکولوم در خاک ميباشد. نتايج اين آزمايش با نتايج حاصل از real-time quantitative PCR که در خاکهاي مشابه انجام شده بود، مقايسه شد و مطابقت زيادي را نشان داد. تحول قابل توجهي که در شناسايي و طبقهبندي قارچها صورت گرفت، استفاده ازRFLP، RAPD، PCR و تعيين توالي DNA بود. PCR يک روش تشخيصي است که به طور گسترده براي شناسايي قارچهاي بيمارگر گياهي مورد استفاده قرار ميگيرد (ميلر[155]، 1996). اخيراً به منظور تشخيص دقيق، اختصاصي و کمي C. coccodes در بافت سيبزميني و خاک، از PCR و real-time PCR استفاده ميگردد (کالن[156] و همکاران، 2002). در سال 1996 دو جفت آغازگر براي ناحيه بين ITS1 و ITS2 توسط سرينيواساپراساد و همکاران طراحي شد. به دليل اينکه آغازگرهاي خارجي Cc1F1 و Cc2R1 و آغازگرهاي داخلي (nested) Cc1NF1 و Cc2NR1، که در دور دوم PCR حساسيت تکثير را بالا ميبرند، براي شناسايي تعداد زيادي از ديگر قارچها و باکتريهاي بيمارگر گياهي از جمله 8 گونه Colletotrichum به کار برده شده و هيچ باندي از آنها حاصل نشده است، به نظر ميرسد که اين آغازگرها اختصاصي C. coccodes باشند. حساسيت اين روش با استفاده از nested PCR برابر 12/0 گرم ميکرواسکلروت در هر گرم خاک ميباشد. 1-2-8- اهميت بيماري خال سياه سيبزميني مشخص شده که مرگ زودرس سيبزميني (PED[157]) که با علائم توقف رشد، پژمردگي، پيري زودرس و کاهش عملکرد همراه است (پاولسون و راو[158]، 1993)، با ترکيبي از عوامل خاکزاد نظير V. dahliae و C. coccodes مرتبط است (تسرور و هازانوفسکي[159]، 2001). اهميت نسبي خال سياه به دليل افزايش تقاضا براي سيبزمينيهاي تازه با ظاهر مناسب، افزايش يافته است. به دنبال اين افزايش تقاضا، بيماريهايي نظير پوسته نقرهاي، پوسته سياه (Rhizoctonia solani) و خال سياه که باعث ايجاد لکه روي غده شده و بازارپسندي آن را کاهش ميدهند و اوائل اهميت چنداني نداشتند، به يک مشکل جدي بدل شدند. انجمن سيبزميني انگلستان بيان کرده است که بيماريهاي خال سياه و پوسته نقرهاي ساليانه تا 5 ميليون پوند به محصولات خسارت وارد ميسازند (آنون[160]، 1998). آلودگي توسط C. coccodes همچنين باعث کاهش عملکرد و افت وزن غده در زمان انبارداري ميشود. هانگر و مکاينتاير[161] در سال 1979 مشاهده کردند که غدههاي داراي بيش از 60% آلودگي به طور متوسط 10% وزن خود را پس از گذشت 18 هفته انبارداري از دست ميدهند، در حاليکه غدههاي داراي 1%-0 آلودگي تنها 5% وزن خود را از دست ميدهند. اين خسارات به دليل آسيب ديدن پريدرم ايجاد ميشوند که با افزايش نفوذپذيري پوست همراه است. با انجام آزمايشات مزرعهاي با آلودگي طبيعي و مصنوعي در انگلستان، مشخص شد که اگرچه عملکرد کل محصول به ندرت توسط بيماري خال سياه تحت تأثير قرار ميگيرد، اما عملکرد غدههاي مناسب براي عرضه به بازار گاهي کاهش مييابد و تعداد غدههاي کوچک نيز زياد ميشود (ريد و هايد، 1995). بر خلاف گفتههاي چسترز و هورنباي (a1965) و زيتر (1989)، که معتقد بودند C. coccodes عامل بيماريزاي مهمي در سيبزميني نيست، تلقيح مصنوعي شاخ و برگ سيبزميني با اين قارچ کاهش عملکرد قابل توجهي را در گياه در ايالت واشنگتن ايجاد کرد. جانسون (1994) طي سالهاي 1991، 1992 و 1993، با انجام آزمايشات مزرعهاي به ترتيب 7، 12 و 11 درصد کاهش عملکرد را در رقم راستبربنک[162] گزارش داد. همچنين طي دو آزمايش گلخانهاي 32 و 19 درصد کاهش عملکرد در گياه مشاهده شد. تسرور و همکاران (b1999) نيز کاهش عملکرد قابل ملاحظهاي را در 5 رقم کاشته شده در خاکهاي آلوده شده به صورت مصنوعي، مشاهده نمودند. C. coccodes همچنين قادر به ايجاد آلودگي پنهان و علائم شديد در گوجهفرنگي و کاهش عملکرد در شرايط کنترل شده آزمايش ميباشد (بارکدول و ديويس، 1992؛ کام و استيونسون، 1978). با اضافه کردن ميکرواسکلروتهاي قارچ عامل بيماري به خاک، عملکرد و رشد گياه سيبزميني به طور قابل ملاحظهاي کاهش مييابد (استيونسون و همکاران، 1976). با آلودهسازي مزرعه، رقم ديررس راستبربنک دچار کاهش عملکرد شد اما در رقم زودرس نورگاولدراست[163] چنين اتفاقي نيفتاد (موهان و همکاران، 1992). محققان ديگر نيز اثرات مخرب اين بيماري را در مزرعه و گلخانه مورد تأييد قرار دادند (12 - 8 درصدکاهش عملکرد در مزرعه و 43 - 29 درصد در گلخانه) (بارکدول و همکاران، 1992؛ جانسون، 1992؛ موهان و همکاران، 1992). در آزمايشات مزرعهاي در اسرائيل، پس از اسپري برگها با سوسپانسيون اسپور و همچنين آغشته سازي خاک با ميکرواسکلروتهاي عامل بيماري، به مدت بيش از سه سال در تعداد زيادي از ارقام کاهش عملکرد مشاهده شد. ميزان کاهش عملکرد در رقم آگريا 27 - 19، ديزاير 27 - 3، آلفا 30 - 5، کارا 25 - 11 و نيکولا 22 - 4 درصد گزارش شده است (تسرور و همکاران، 1994؛ تسرور، 1998). 1-2-9- اپيدميولوژي بيماري خال سياه سيبزميني پتانسيل بيماريزايي غدههاي بذري آلوده به C. coccodes ابتدا در کانادا مورد توجه قرار گرفت (ديکسون، 1926). در مزرعه آلودگي گياه توسط C. coccodes از طريق اينوکولوم خاکزاد، غدهزاد و هوازاد صورت ميگيرد. اين منابع اينوکولوم ممکن است به تنهايي يا به همراه هم در ايجاد بيماري دخالت داشته باشند (جانسون، 1994؛ جانسون و ميليزکي، 1993؛ موهان و همکاران، 1992؛ تسرور و همکاران، 1999). اينوکولوم غدهزاد و خاکزاد مهمترين منابع اينوکولوم به حساب ميآيند اما آلودگي هوازاد نيز ممکن است نقش مهمي در آغاز و توسعه بيماري ايفا کند. وقتي غدههاي بذري آلوده در مزرعه کاشته شوند، علائم بيماري در ريشهها و غدههاي دختري ايجاد شده و گياه بسيار ضعيف رشد ميکند. غدههاي داراي آلودگي زياد به صورت قابل توجهي بيماري شديدتري نسبت به غدههاي عاري از آلودگي ايجاد ميکنند (ريد و هايد، 1995). دشوود[164] و همکاران در سال 1992 دريافتند که ميزان آلودگي ريشه به C. coccodes در گياهان رشد يافته از غدههاي بذري دو برابر بيشتر از ريشه گياهان ريز تکثير يافته است که اين امر گوياي اين حقيقت است که اينوکولوم غدهزاد به ميزان قابل توجهي در ميزان آلودگي نقش دارد. اعتقاد بر اين است که غدههاي بذري سيبزميني فاکتور مهمي در رابطه با ورود بيمارگر به مزارع سالم ميباشد. کلونيزاسيون غدهها توسط C. coccodes به شدت تحت تأثير واحدهاي تشکيل دهنده کلوني (CFU) در خاک است. طبق مشاهدات بارکدول و ديويس (1992)، تمامي چهار جدايه به دست آمده از خاک به دنبال آلودهسازي مصنوعي قادر به ايجاد علائم روي برگهاي سيبزميني بوده و اين نشانگر نقش مهم اينوکولوم خاکزاد در ايجاد بيماري است. اين قارچ به مدت طولاني به صورت ميکرواسکلروت روي غدههاي آلوده، بقاياي گياهي و داخل خاک بقاء پيدا ميکند. پس از گذشت 83 هفته، 53% از ميکرواسکلروتهاي روي غدهها در عمق 5/2 سانتيمتري خاک و در شرايط مرطوب گلخانه زنده مانده بودند (بلکمن[165] و هورنباي، 1966). پس از گذشت 8 سال به ترتيب 55، 91 و 92 درصد از ميکرواسکلروتها روي سطح خاک، عمق 10 سانتيمتري و عمق 20 سانتيمتري خاک دوام آورده بودند (ديلارد و کاب[166]، 1998). نتايج اخير با استفاده از روشهاي مبتني بر PCR نشان دادند که C. coccodesدر خاکهايي که به صورت طبيعي آلوده به قارچ مورد نظر هستند و به مدت 5، 8 و 13 سال زير کشت سيبزميني نرفتهاند، قابل رديابي است (کالن و همکاران، 2002). C. coccodesقادر است توسط باد نيز جابهجا شود (جانسون، 1994). ديگر منابع اينوکولوم شامل بقاياي گياهي و ميزبانهاي واسط هستند. 1-2-10- پراکنش ودامنه ميزباني بيماري خال سياه سيبزميني بيماري خال سياه در تمام مناطق سيبزمينيکاري جهان شامل افريقا، آسيا، استراليا و امريکا گسترده است (مردو، 1967). اکثر گزارشات مربوط به بيماري از امريکاي شمالي (رايد[167] و پنيپاکر، 1987)، اروپا (اندريون و همکاران، 1997)، استراليا (هريسون[168]، 1963) و افريقاي جنوبي، منطقهاي که به علت حساسيت بالاي ارقام بومي شيوع بيماري در آنجا بالا است (دنر و ماريس[169]، 1989)، ميباشد. اين بيماري همچنين در کشورهاي فرانسه، انگلستان، ايرلند، کانادا، آلمان، بلژيک، ايتاليا و برزيل نيز انتشار داشته و در ايران در مناطق آذربايجان، فارس، قزوين، همدان، زنجان، اصفهان، خراسان، خوزستان و احتمالاً ساير مناطق شيوع دارد (بهداد، 1375). در بررسي بيماريهاي قارچي و باکتريايي بذرزاد در سيبزمينيهاي بومي و وارداتي اسرائيل، 34% بستههاي وارد شده از هلند در سال 1998 آلوده به بيماري خال سياه بودند (تسرور و همکاران، a1999). با بررسي انجام شده در سالهاي 90-1989 در انگلستان مشخص شد که بيماريهاي خال سياه، پوسته نقرهاي و پوسته سياه به ترتيب به ميزان 75، 86 و 85 درصد در محصولات سيبزميني مورد بررسي وجود دارند (ريد و همکاران، 1995). توزيع و گسترش بيماري در تمام نقاط دنيا بالا است (ليز و هيلتن[170]، 2003). در تحقيقي كه در سال هاي 1999 و 2000 در انگلستان و ولز انجام شد مشخص شد که شيوع نسبي خال سياه در جنوب شرق و نواحي مركزي، بين 70 تا 100 درصد بوده است (بردشاو[171] و همكاران، 2002). حسان و کريمي در سال 1372 آلودگي مزارع سيبزميني به خال سياه را در سه استان تهران، همدان و زنجان مورد بررسي قرار دادند و تفاوتهاي آشکاري را بين آنها مشاهده کردند. C. coccodesعلاوه بر خال سياه، باعث ايجاد آنتراکنوز روي گوجهفرنگي با علائمي نظير لکههاي دايره مانند، آبسوخته و فرو رفته (ديلارد، 1989) نيز شده و قادر به آلودهسازي حداقل 35 ميزبان ديگر از 13 خانواده ازجمله Cucurbitaceae، Fabaceae و Solanaceae است (چسترز وهورنباي، b1965) ولي بيشترين خسارت آن روي سيب زميني و گوجه فرنگي مي باشد (ديلارد، 1992). رايد و پنيپاکر (1987) با آلودهسازي شاخ و برگ و ريشه علفهاي هرز موجود در مزرعه گوجهفرنگي در پنسيلوانياي امريکا، 15 گونه علف هرز را شناسايي کردند که نقش ميزبان واسط قارچ را ايفا ميکنند. 1-2-11- تنوع قارچ C. coccodes مطالعه وجود تنوع در ميان جدايههاي C. coccodes روي بررسي شکل ظاهري پرگنه و بيماريزايي متمرکز شده است. کندريخ و والکر[172] (1948) با بررسي 147 جدايه به دست آمده از گوجهفرنگي دريافتند که آنها داراي ويژگيهاي رشدي متفاوتي اعم از رنگ پرگنه ، وجود ميسليومهاي زميني يا هوايي و اندازه و تعداد ميکرواسکلروتها هستند. تو و پويزا[173] (1997) نيز از بين 435 جدايه به دست آمده از ميوه و برگ گوجهفرنگي، حداقل 15 بايوتيپ متفاوت را از لحاظ تفاوت در ويژگيهاي فنوتيپي (نظير بيماريزايي و ريختشناسي پرگنه) تشخيص دادند. طبق گزارش ايلمن[174] و همکاران در سال 1959، جدايههاي به دست آمده از سيبزميني از لحاظ مورفولوژيکي قابل تشخيص از جدايههاي به دست آمده از گوجهفرنگي نيستند و قادر به ايجاد آنتراکنوز روي گوجهفرنگي ميباشند. با انجام تستهاي آزمايشگاهي نيز همين مقدار تنوع در جدايههاي به دست آمده از ريشه گوجهفرنگي، آنتراکنوز گوجهفرنگي و خال سياه سيبزميني مشاهده گرديد (چسترز و هورنباي، a 1965). باركدل و ديويس (1992) 9 جدايه از C. coccodes را از نظر توانايي آنها در ايجاد علائم روي شاخ و برگ رقم راستبربنك سيبزميني بررسي كردند و تفاوت هايي را در بيماريزايي اين جدايهها روي شاخ و برگ مشاهده نمودند. شواهد محدودي مبني بر وجود نژادهاي فيزيولوژيك بين جدايه هاي C. coccodes وجود دارد. نيتزان و همكاران (2002) چهار گروه سازگاري رويشي چند عضوي را در 110 جدايه C. coccodes از اسرائيل، هلند و فرانسه تشخيص دادند و همچنين بيان نمودند كه تنوع گروه هاي سازگاري رويشي ممكن است در رابطه با خصوصيات بيماريزايي جدايه ها باشد. علاوه بر تعيين خصوصيات فنوتيپي، استفاده از روش هاي بيوشيميايي پيشرفت هاي عظيمي را در جهت درك تنوع بين گونه اي و درون گونه اي Colletotrichum ايجاد کرده است. به عنوان مثال مشخص شده است كه بر اساس الگوهاي ايزوآنزيمي، جدايه هاي C. coccodes از ساير گونه هاي Colletotrichum بيماريزاي توتفرنگي قابل تفکيک هستند اما تنوعي در ايزوآنزيم هاي درونگونه اي در C. coccodes مشاهده نشده است (باند[175] و همكاران، 1991). AFLP به دليل اينکه از مقادير کم DNA الگو قطعات زيادي توليد ميکند، قادر به تعيين اساس ژنتيکي و مولکولي خصوصيات بيولوژيکي قارچهاي بيمارگر گياهي است و همچنين تکرار پذير ميباشد، يک تکنيک بسيار قوي به حساب ميآيد (اونيل[176] و همکاران، 1997). AFLP در سال 1997 توسط اونيل و همکاران به منظور تعيين تنوع ژنتيکي Colletotrichumهاي بيمارگر يونجه مورد استفاده قرار گرفت. در اين بررسي مشخص شد که تنوع حاصل از AFLP در بين گونههاي Colletotrichum با طبقهبندي قبلي که بر اساس شکل ظاهر، توالي rDNA و نشانگر RAPD صورت گرفته بود، مطابقت دارد. مطالعات صورت گرفته بر پايه AFLP، تنوع کمي را در بين جدايههاي مختلف C. coccodesجدا شده از سيبزميني نشان داده است. در سال 1385 ناحيه ITS 26 جدايه از گونههاي مختلف Colletotrichum با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي توسط طراح تکثير و توالي يابي شد. بر اين اساس شباهت بسيار بالايي در توالي ژن 5.8S بين جدايهها مشاهده شد. بيشترين اختلاف گونه هاي Colletotrichum در بخش ITS1 بود. بخش ITS2 جدايه ها نيز مانند بخش ITS1 داراي تنوع بود ولي ميزان تنوع ITS2 بسيار كمتر از ITS1 بود. توالي نواحي ITS در تمام جدايه هاي مورد بررسي C. coccodesتقريباً به طور كامل شبيه هم بود و فقط دو جدايه در يك يا دو نوكلئوتيد با بقيه جدايه ها تفاوت داشتند. بر اساس دندروگرام رسم شده كل جدايه ها در يك گروه با ارزش bootstrap صد در صد قرار گرفتند. قرار گرفتن همه نمونه ها در يك گروه نشان مي دهد كه اين گونه ها شباهت نزديكي به هم دارند (طراح، 1385). 1-2-12- کنترل بيماري خال سياه سيبزميني الف- کنترل زراعي تناوب زراعي در تعدادي از بيمارگرهاي خاکزاد قادر به کاهش ميزان اينوکولوم ميباشد (هانيکات[177] و همکاران، 1996). از آنجائيکه ميکرواسکلروتهاي C. coccodes بيشتر از دو سال در خاک دوام ميآورند، به منظور جلوگيري از استقرار قارچ در خاک، تناوب بايد به مدت سه تا چهار سال ادامه پيدا کند (ديلارد، 1987، 1990). رايد و پنيپاکر (1987) با آلودهسازي شاخ و برگ و ريشه علفهاي هرز موجود در مزرعه گوجهفرنگي در پنسيلوانياي امريکا، 15 گونه علف هرز را شناسايي کردند که نقش ميزبان واسط قارچ را ايفا ميکنند. قبل از اجراي اقدامات کنترلي، نياز است مطالعات بيشتري پيرامون نقش علفهاي هرز به عنوان ميزبان و منبع اينوکولوم انجام گيرد. به دليل امکان ورود دوباره بيمارگر از طريق غدههاي آلوده، تناوب و ديگر اقدامات صورت گرفته در جهت کاهش اينوکولوم خاکزاد C. coccodes ارزش کمي دارند (کام و استيونسون، 1978). به نظر ميرسد آفتابدهي و شخم عميق در کنترل بيماري نقش داشته باشند. به عنوان مثال، آفتابدهي به مدت 8 هفته باعث افزايش دماي 5 سانتيمتر بالايي خاک شده و شدت بيماري را به ميزان 45% کاهش داده است. شخم عميق تا عمق 30 سانتيمتر، تا 34% باعث کاهش بيماري خال سياه شده است. توسعه بيماري هم زمان با پير شدن ساقه اين تصور را ايجاد ميکند که از بين بردن ساقههاي خشکيده در کاهش بيماري مؤثر باشد. برداشت زود هنگام محصول نيز در کاهش آلودگي غدهها مؤثر است (هايد و بورر، 1991؛ هايد و همکاران، 1994). استفاده از غدههاي عاري از آلودگي (زيتر و همکاران، 1989) و کاشت در خاکهاي داراي زهکش مناسب (ديلارد، 1989؛ زيتر و همکاران، 1989) نيز از ديگر اقدامات کنترلي ميباشند. بر اساس گزارش نصراصفهاني و مرتضويبک (1379)، جدايهاي از Trichoderma harzianum در کنترل بيماري خال سياه مؤثر است. ب- کنترل شيميايي هيچ قارچکش اختصاصي براي کنترل بيماري خال سياه وجود ندارد و تحقيقات روي امکان ضدعفوني بذر در مورد ساير بيمارگرهاي خاکزاد مثل R. solani و H. solani متمرکز شده است. در حال حاضر کنترل بيماري از طريق سموم شيميايي مؤثر واقع نميشود. در گذشته قارچکشهاي جيوهاي کنترل مؤثري را در مرحله پس از برداشت داشتند (جليس و تيلر[178]، 1974) اما در کشاورزي پيشرفته جايي ندارند. در افريقاي جنوبي غدههاي سيبزميني قبل از کاشت در قارچکشهاي پروکلراز[179]، تيابندازول[180]، کاپتوفال[181] و کلراميزول سولفات[182] غوطهور ميشوند (ماريس، 1990). اگرچه ترکيب کلراميزول سولفات و پروکلراز به ميزان قابل توجهي شدت بيماري خالسياه را در مقايسه با شاهد در غدههاي دختري کاهش داد، ديگر تيمارها هيچ اثري از خود نشان ندادند. اسپري قارچکش روي شاخ و برگ ممکن است ميزان بيماري و به دنبال آن افت عملکرد را کاهش دهد. بنابراين، توليد ميکرواسکلروت روي اندامهاي مرده گياهي کاهش يافته و در نتيجه آلودگي خاک نيز کم ميشود (پراسکي، 2000). استفاده از ازوکسياستروبين[183] در دو رقم مختلف سيبزميني به ترتيب 13 و23 درصد افزايش عملکرد به همراه داشت. شدت بيماري در قسمتهاي بالا و زير خاک ساقه به ترتيب 81 - 19 و 81 - 22 درصد کاهش يافت. همچنين آلودگي غدههاي حاصل از اين گياهان 26 - 9 درصد کمتر از گياهان تيمار نشده با قارچکش بود. در واقع چند مرحله کاربرد ازوکسياستروبين به صورت اسپري روي سطح برگ، ميزان بيماري را در ساقهها و غدههاي سيبزميني کاهش داد (نيتزان و همکاران، 2005). مطالعات زيادي پيرامون استفاده از قارچکشها به صورت آغشتهسازي بذور، به منظور کنترل بيماري خال سياه انجام گرفته است. طبق گزارش دنر[184] و همکاران در سالهای 1997 و 1998، کاربرد پروکلراز، انتقال بيماري را از غدههاي بذري به غدههاي دختري کاهش ميدهد. همچنين کاربرد ايمازاليل[185] در غدههاي به شدت آلوده، باعث کاهش بيماري در اوائل فصل شده ولي ميزان آن را در غدههاي دختري کاهش نميدهد (ريد و هايد، 1995). بخاردهي خاک نيز در کنترل اينوکولوم خاکزاد قارچي در مزرعه به کار ميرود. در افريقاي جنوبي، بخاردهي خاک با متيلبرومايد به ميزان 126 گرم در متر مکعب ميزان بيماري را از 41% به 1% کاهش داده است (دنر و همکاران، 1998). با وجود اين، بخاردهي خاک در سطح وسيع از نظر اقتصادي به صرفه نميباشد. ج- ارقام مقاوم در حال حاضر اطلاعات کمي مبني بر وجود مقاومت طبيعي به بيماري خال سياه در ارقام تجاري سيبزميني وجود دارد. در بررسيهاي مزرعهاي مشخص شده که ارقام زودرس نسبت به بيماري خال سياه، عموماً حساستر از ارقام ديررس ميباشند (ريد، 1991، اندريون و همکاران، 1997). طبق گفتههاي هانگر و مکاينتاير (1979)، علائم بيماري در ارقامي که داراي پوست نازک هستند بيشتر از ارقام داراي پوست ضخيم است. ريد (1991) معتقد است که تغيير رنگ ايجاد شده در پوست توسط بيماري خال سياه در ارقام داراي پوست سفيد به وضوح بيشتر از ارقام داراي پوست قرمز ميباشد. البته اين نتايج با گفتههاي جليس و تيلر (1974) در تضاد است. آنها بيان کردهاند که بيماري در غدههاي رنگي به طور قابل توجهي بيشتر است. در آينده، فهم مکانيزمهاي مقاومت ميتواند به توليد ارقام داراي مقاومت بيشتر نسبت به بيماري کمک کند. امروزه روشهاي استانداردي جهت شناسايي مقاومت به خال سياه در شرايط کنترل شده محيطي ايجاد شدهاند (گنس[186] و همکاران، 2002). 1-3- اثر متقابل بين دو بيمارگر هر گياهي در طول دوره رشد خود تحت تأثير عوامل زنده يا غيرزنده قرار ميگيرد. از جمله عوامل غيرزنده ميتوان به خاک، عناصر مختلف، رطوبت و دما اشاره کرد. عوامل زنده نيز شامل ميکرواورگانيسمهاي مختلف ميباشند. گياهان معمولاً تحت تأثير مجموعهاي از اين عوامل قرار دارند که رشد گياه و سالم بودن آن وابسته به آنها ميباشد. در اين بين، از آنجا که عوامل بيماريزا باعث ايجاد خسارات مهمي در گياهان، خصوصاً محصولات مهم اقتصادي ميشوند، حائز اهميت بسياري ميباشند. هر بيمارگر به نوبه خود آسيبهايي را به گياه وارد ميسازد که در برخي موارد جبران ناپذير ميباشد. حضور همزمان دو يا چند بيمارگر در گياه ميتواند متعاقباً خسارات بيشتري را در پي داشته باشد، حتي ممکن است در حضور يک بيمارگر ثانويه، نقش بيمارگر ضعيف در ايجاد بيماري پررنگتر شود. بنابراين، داشتن اطلاعاتي راجع به نحوه اثر و روابط بيمارگرها، به منظور مديريت بهتر بيماري و همچنين کاهش خسارات وارده، ضروري مينمايد. به همين دليل، مطالعات زيادي پيرامون اثر متقابل بيمارگرهاي مختلف و اثر آنها روي کاهش عملکرد و ديگر ويژگيها، از گذشته تا به حال انجام گرفته که نمونههايي از آنها ذيلاً آورده شده است. V. dahliaeعامل مهمي در کاهش عملکرد سيبزميني، خصوصاً در مزارعي است که سالهاي متوالي زير کشت اين محصول بودهاند (براون[187] و همکاران، 1980؛ هريسون و ايساک[188]، 1969). مواردي از اثر متقابل بين اين بيمارگر و ساير بيمارگرها گزارش شده است (الشکري[189]، 1968؛ کاتاني و پترسون[190]، 1967؛ گادمستاد[191] و همکاران، 1977؛ جليسون[192] و همکاران، 1980؛ ميشل[193] و همکاران، 1980). مواردي از حضور همزمان C. coccodes و V. dahliae نيز در سيبزميني مشاهده شده است (ديويس و هوارد[194]، 1976؛ اوتازو[195] و همکاران، 1978). با دانستن اين نکته که V. dahliaeدر گياهاني که دچار استرس تغذيهاي شدهاند، شديدتر است و نيز ويروس X سيبزميني قادر است به شدت گياه را تحت تأثير قرار دهد، اين فکر به ذهن خطور ميکند که گياهان آلوده به ويروس نسبت به V. dahliae حساستر ميباشند. اثر متقابل بين بيماريهاي قارچي و ويروسي توسط چند محقق گزارش شده است (بتمن[196]، 1961؛ بنيوال و گاداسکاس[197]، 1972؛ فارلي و لاکوود[198]، 1964؛ مولن[199] و بتمن، 1975). به عنوان مثال، ظهور علائم ناشي از V. dahliae يا Fusarium spp. در گوجهفرنگي ممکن است در حضور ويروس موزائيک توتون تغيير کند (تاناسولوپولوس[200]، 1976). بر اساس گفتههاي جونز[201] و مولن (1974)، ويروس PVX حساسيت غدههاي سيبزميني را نسبت به F. roseum کاهش ميدهد. در مطالعه اثر متقابل بين ويروس PVX، V. dahliae و C. coccodes در سيبزميني توسط گودل[202] و همکاران در سال 1982، مشخص شد که PVX اثري روي ايجاد آلودگي به V. dahliae ندارد اما آلودگي به PVX با وجود جمعيت بالاي V. dahliaeدر ساقه سيبزميني در ارتباط است. در مقابل، آلودگي به C. coccodes و کلونيزاسيون ساقه رابطه معکوسي با PVX دارد. بررسيهاي انجام شده توسط بارپي و بلوم[203] (1978) در گلخانه نتوانست اثر متقابل بين V. dahliae و Pratylenchus را مشخص کند. در بررسي ديگري که در سال 1973 توسط گولد[204] انجام گرفت، شدت علائم ناشي از V. dahliaeدر حضور Pratylenchus افزايش يافت. همچنين در حضور هر دو بيمارگر نسبت به زماني که قارچ به تنهايي در گياه وجود دارد، با کاهش عملکرد بيشتري مواجه هستيم (مارسينک[205]، 1967). در اسرائيل، برهمکنش بين P. thornei با V. dahliaeباعث افزايش شدت پژمردگي ورتيسيليومي و وقوع زودتر آن شد (سيتي[206]، 1979). Erwinia carotovora و V. dahliae ممکن است باعث ايجاد مرگ زودرس شوند (پاولسون،1980) و احتمالاً C. coccodes نيز يکي ديگر از عوامل دخيل در آن ميباشد (استيونسون و همکاران، 1976). يکي ديگر از بررسيهاي انجام شده در مورد اثر متقابل نماتد و قارچ، توسط مارتين و همکاران در سال 1982 انجام گرفت. در اين بررسي وزن ريشه، اندام هوايي و غده در مقايسه با شاهد کاهش پيدا کرده بود. علائم مرگ زودرس سيبزميني در حضور V. dahliaeو E. carotovora pv. carotovora در مقايسه با هر يک از عوامل به تنهايي شديدتر است و در واقع دو بيمارگر اثر تشديدکنندگي روي هم دارند. همچنين، رشد گياه کاهش يافت و علائم پژمردگي و کلروز و توسعه پوسيدگي نرم ساقه افزايش قابل ملاحظهاي را در پي داشتند (رحيميان و ميشل، 1984). کاتکان و همکاران (1985) اظهار داشتند که برهمکنش بين V. dahliae، C. coccodes،Rhizoctonia solani و Pratylenchus penetrans کاهش عملکرد قابل توجهي را در پي ندارد اما حضور V. dahliae و P. penetrans نقش فزايندهاي را در ظهور علائم دارد. V. dahliaeمستقيماً با کاهش رشد ريشه، وزن شاخ و برگ و عملکرد غده در ارتباط است. P. penetransشدت علائم ناشي از سندروم مرگ زود هنگام سيبزميني را در خاکهاي آلوده بهV. dahliaeافزايش ميدهد. نماتد باعث توقف رشد، زردي و پيري زودرس شده اما کاهش عملکرد به همراه ندارد. C. coccodesو R. solaniاثر مستقيمي روي علائم، رشد گياه يا عملکرد ندارند. تسرور و هازانوفسکي در سال 2001 اثر تلقيح همزمان C. coccodes و V. dahliae را در سه غلظت مختلف و در چهار رقم سيبزميني مورد بررسي قرار دادند. بر اساس نتايج حاصل مشخص شد که در برخي ارقام حضور V. dahliae باعث افزايش تعداد ميکرواسکلروتهاي C. coccodes شده و در دو رقم ديگر وجود C. coccodes ميزان ميکرواسکلروتهاي V. dahliae را کاهش داده است. حضور دو بيمارگر به همراه هم در گياه در بعضي موارد اثر معنيداري روي پارامترهاي گياه نداشته اما گاهي نيز باعث کاهش آنها شده است. در بررسي برهمکنش بين C. musae و Lasidiodiplodia theobromae در موز، اين نتايج به دست آمد که اولاً، L. theobromae از اهميت بيشتري در موز برخوردار ميباشد و دوماً، ميزان بيماري در حضور دو بيمارگر نسبت به بيماري ايجاد شده توسط هر يک به تنهايي، کمتر است. پس ميتوان گفت که دو بيمارگر اثر آنتاگونيستي روي هم دارند (نيروشينيگاناسينگ[207] و همکاران، 2009). ريد[208] و همکاران در سال 1999، برهمکنش بين F. graminearum و F. moniliformeو اثر آنها روي پيشرفت بيماري، بيومس[209] قارچي و تجمع مايکوتوکسين را در ذرت مورد بررسي قرار دادند. پس از سه سال آزمايش، بيشترين ميزان بيماري و تجمع ارگوسترول[210] مربوط به F. graminearum بود و مقادير بعدي به ترتيب به ترکيب دو بيمارگر و F. moniliformeتعلق داشتند. همچنين برهمکنش بين Meloidogyne artielliaو نژاد 5 F. oxysporum f. sp. ciceris در نخود توسط کاستيلو[211] و همکاران (2003) مورد مطالعه قرار گرفت. در ژنوتيپهاي داراي مقاومت نسبي به F. oxysporum، آلودگي به نماتد به طور قابل توجهي شدت پژمردگي باکتريايي را افزايش داد. در دو مورد در ژنوتيپ کاملاً مقاوم به F. oxysporum، حضور نماتد باعث شکسته شدن مقاومت به قارچ شد اما در مورد ديگر اين اتفاق نيفتاد. در واقع نماتد به ميزان قابل توجهي باعث افزايش تعداد پروپاگولهاي قارچ در ژنوتيپ مقاوم شده بود. در لوبيا، F. solani f. sp. phaseoli و Pythium ultimum روي هم اثر تشديدکننده دارند، يعني پوسيدگي ريشه لوبيا در حضور اين دو بيمارگر شديدتر است. هيچ برهمکنشي بين R. solaniو F. solani f. sp. phaseoli مشاهده نشد. با وجوداين، R. solani به شدت پوسيدگي ريشه ناشي از P. ultimum را کاهش داد که نشاندهنده اين است که در اينجا اثر آنتاگونيستي وجود دارد (پيزارکا و ابوي[212]، 1978). شدت بيماري پژمردگي باکتريايي در صورت همراه شدن نماتد بيمارگر ريشه در اکثر موارد افزايش مييابد. در توتون، آلودگي به نماتد فيزيولوژي گياه را تغيير داده و باعث حساسيت آن به پژمردگي باکتريايي ميشود (چن[213]، 1984). مطالعات انجام شده در هند نشان دادهاند که اثرات بيماريزايي R. solanacearum و Meloidogyne javanica به همراه هم بيش از اثرات هر يک از آنها به تنهايي است (سيتاراميا و سينها[214]، 1984). 1-4- بررسيهاي ژنتيکي عوامل بيماريزاي گياهي معمولترين مارکرهاي ژنتيکي مورد استفاده در بررسي موجودات مختلف، مارکرهاي مورفولوژيکي، مارکرهاي مولکولي (در سطح DNA) و مارکرهاي بيوشيميايي (آيزوزايمها، پروتئينها) ميباشند. در اين تحقيق، به منظور بررسي برخي از خصوصيات ژنتيکي C. coccodes و R. solanacearum از اين مارکرها استفاده شده که توضيح آنها در ذيل آورده شده است. 1-4-1- مارکرهاي مولکولي ابزارهاي مولکولي بر پايه استخراج DNA از نمونههاي بيولوژيکي و تکثير آنها با استفاده از واکنش زنجيرهاي پليمراز (PCR) براي غلبه بر محدوديتهاي روشهاي معمول آزمايشگاهي در شناسايي عوامل بيماريزاي مختلف، ايجاد شدهاند. تعدادي از اين مارکرها به صورت روزمره براي رديابي قارچهاي موجود در خاک در محيط طبيعي مورد استفاده قرار ميگيرند (بريج و اسپونر[215]، 2001). عدم نياز به کشت عامل مورد نظر قبل از شناسايي، سريع، حساس و اختصاصي بودن از مزاياي روشهاي مبتني بر PCR در مقايسه با ديگر روشهاي تشخيصي ميباشند. اين روشها با استفاده از تنوع توالي DNA در نواحي ITS، توالي DNA ريبوزومي، کلون کردن قطعات مختلف DNA ژنومي، استفاده از قطعات توالييابي شده به دست آمده از RAPD و غيره توسعه مييابند (بالات و ميروننکو[216]، 1996). الف- نشانگر RAPD[217] RAPD نوعي واکنش PCR است که قطعات حاصل از آن به صورت تصادفي تکثير شدهاند. از RAPD ميتوان براي تعيين تنوع بين گونهاي و تفاوت بين افراد مختلف استفاده کرد (وش و مککلاند[218]، 1990؛ ويليامز[219] و همکاران، 1990). در اين نشانگر از آغازگرهاي اليگونوکلئوتيدي کوتاه با طول 10 باز استفاده ميگردد. اين آغازگرها تواليهاي ناشناخته را در ژنوم مورد هدف قرار داده و اغلب باعث ايجاد قطعاتي با اندازههاي مختلف ميشوند. RAPD امکان تعيين پليمورفيسم را بدون داشتن دانش قبلي در مورد توالي DNA موجود مورد نظر فراهم ميآورد. الگوهاي باندي ايجاد شده در RAPD خيلي متفاوت هستند و در صورت استفاده از تعداد آغازگر کافي، جدايههاي گونهها نيز از هم قابل تشخيص ميباشند. RAPD يک روش سريع و اقتصادي براي غربال تعداد زيادي نمونه ميباشد. اما برخي از محققين روي تکرارپذيري پايين اين روش تأکيد دارند. بر اساس گفتههاي تامراپ[220] و همکاران (1995) تکرارپذيري آن در آزمايشگاه معمولاً رضايتبخش ميباشد. اما به دليل اينکه تحت تأثير فاکتورهاي تکنيکي زيادي قرار دارد، مقايسه نتايج حاصل از آن در آزمايشگاههاي مختلف هميشه کاربردي نيست (پنر[221] و همکاران، 1993). براي اينکه نشانگرهاي RAPD بتوانند به عنوان يک روش تشخيصي توسط گروه بزرگي از محققان مورد استفاده قرار گيرند، لازم است با جداسازي، کلون کردن و تعيين توالي قطعات حاصل به منظور طراحي پروب[222] يا آغازگرهاي اختصاصي (SCAR[223])، بيشتر مورد بررسي قرار گيرند. محدوديت اصلي RAPD داشتن صفت غالبيت است. بنابراين، به دليل اينکه در موجودات ديپلوئيد، هموزيگوتها و هتروزيگوتها خصوصيات RAPD يکساني دارند، از هم قابل تشخيص نميباشند. 1-4-2- مارکرهاي بيوشيميايي الف- SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis تکنيکي است که به ميزان گسترده در بيوشيمي، ژنتيک و زيستشناسي مولکولي به منظور جداسازي پروتئينها استفاده ميگردد. در اين روش از ژل پلياکريلآميد غيرپيوسته به عنوان يک محيط نگهدارنده و سديمدودسيلسولفات براي شکستن ساختمان ثانويه پروتئينها استفاده ميشود که به نام روش لاملي[224] نيز معروف است. لاملي اولين کسي بود که راجع به کاربرد SDS-PAGE در مطالعات علمي، مقالهاي ارائه داد. در ژل غيرپيوسته از بافرهاي متفاوتي در تانک و ژل استفاده ميشود. حتي درون ژل نيز از دو بافر با pH متفاوت استفاده ميگردد. مزيت ژل غيرپيوسته نسبت به ژل پيوسته، که در آن تنها از يک بافر استفاده ميشود، اين است که باندها ابتدا در يک نوار باريک جمع شده و بنابراين پروتئينها با وضوح بيشتري از هم جدا ميشوند. ژل مورد استفاده، شبکهاي تشکيل شده از اکريلآميدهاي متصل به هم ميباشد. معمولترين روش ايجاد اين ماتريکس، ايجاد برهمکنش بين اکريلآميد و بيساکريلآميد است که توسط دو ترکيب ديگر (آمونيومپرسولفات[225] و تمد[226]) کاتاليز ميشود. ژل اکريلآميد موقعي شکل ميگيرد که مخلوط اکريلآميد و بيساکريلآميد در زنجيرههاي بلند کووالانت پليمريزه شوند. با استفاده از SDS نقش بار و شکل پروتئين از بين ميرود و جداسازي به آهستگي بر اساس وزن مولکولي صورت ميگيرد. SDS تقريباً با همه پروتئينها باند شده و ساختمان آنها را تخريب ميکند. همچنين باعث باز شدن پيوندها و از بين رفتن ساختمان فضايي پروتئينها شده و پروتئينهاي ميلهاي شکلي را ايجاد ميکند که به آساني داخل ژل حرکت ميکنند. اين دترجنت با نسبت ثابت 4/1گرم بر هر گرم پروتئين، به همه پروتئينها ميچسبد که ايجاد بار منفي کرده و اثر بار واقعي پروتئين را محو ميکند (وايتفورد[227]، 2005). از کاربردهاي SDS-PAGE ميتوان به اندازهگيري ميزان خلوص پروتئينها، تعيين جرم مولکولي نسبي پروتئين، شناسايي تنوع پروتئينها، تهيه نقشههاي پپپتيدي و ... اشاره کرد (سيمپسون[228]، 2003). [1]Hooker [2]Food and Agriculture Organization [3] China [4]Benin [5]Late Blight [6]Kotcon [7]Tsror [8]Hazanovsky [9]SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis [10]Polymerase Chain Reaction [11]Erwin F. Smith [12]Buddenhagen [13]Hayward [14]Boucher [15]Denny & Schell [16]Kelman [17]Dunckle [18]Agrios [19]Schaad [20]Tri phenyl Tetrazolium Chloride [21]Champoiseau [22]Viable But Non-Culturable state [23]van Elsas [24]Vasse [25] Wallis &Truter [26]Genin & Boucher [27]Lemessa Ocho [28]Elphinstone [29]Prior [30]Acetosyringone [31]Stachel [32]Extracellular Polysaccharide [33]Pilli [34]Fimberia [35]Buddenhagen [36]Sequeira [37]Chatterjee [38]Denny & Baek [39]Kao [40]Araud-Razou [41]Saile [42]Transposon [43]Cook [44]Xu [45]Lypopolysaccharide [46]Yabuuchi [47]Fegan [48]Okabe & Goto [49]Palleroni [50]Li [51]Poussier [52]Sequivar [53]Seal [54]Allen [55]Rodrigues-Neto [56]McCarter [57]Swanson [58]Echandi [59]Ciampi [60]Priou [61]Weller [62]Indirect immunofluorescence antibody staining [63]Fluorescent in situ hybridization [64]Wullings [65]Fouche-Weich [66]Olsson [67]Zehr [68]French [69]Volcani & Palti [70]Zachos [71]Department for Environment, Food and Rural Affairs of United Kingdom [72]Janse [73]Momol [74]Bradbury [75]Moko [76]bugtok [77]Boshou [78]Hanson [79]Pradhanang [80]Scott [81]Jaworski [82]Gonzalez & Summers [83]Hong Hai [84]Zimnoch-Guzowska [85]French & De Lindo [86]Rowe [87]Saddler [88]Murakoshi & Takahashi [89]Farag [90]Autrique & Potts [91]Granada [92]Vijayakumar [93]Graham & Lloyd [94]Shekawat [95]Shamsuddin [96]Anith [97]Ji [98]Norman [99]Dokken [100]Sutton [101]Setae [102]Bailey [103]Barnett & Hunter [104]Cano [105]Skipp [106]Cannon [107]Jamil & Nicholson [108]McIntyre & Rusanowski [109]Davis & Johnson [110]Farley [111]Chesters & Hornby [112]Komm & Stevenson [113]Barkdoll [114]Dillard [115]Ducomet [116]Dickson [117]Zitter [118]Mohan [119]Melanconiales [120]Melanconiaceae [121]Hyphomycetes [122]Stroma [123]Phialostromatineae [124]Alexopoulos [125]Siefert & Gams [126]Phyllachorales [127]Von Arx [128]Sreenivasaprasad [129]Freeman [130]Martin & Garcia-Figueres [131]Abang [132]Paavolainen [133]Fagbola [134]Sherriff [135]OConnell [136]Latunde-Dada [137]Hemibiotrophic [138]Ducomet [139]Schmiedeknecht [140]Andrivon [141]Fulton [142]Tu [143]Mordue [144]Firman & Allen [145]Hide & Boorer [146]Miliczky [147]Sanogo & Pennypacker [148]Glais-Varlet [149]Read [150]Errampalli [151]Prusky [152]Nitzan [153]Carnegie [154]Bioassay [155]Miller [156]Cullen [157]Potato Early Dying [158]Powelson& Rowe [159]Hazanovsky [160]Anon [161]Hunger & McIntyre [162]Russett Burbank [163]Norgold Russett [164]Dashwood [165]Blakeman [166]Cobb [167]Raid [168]Harrison [169]Marais [170]Lees & Hilton [171]Bradshaw [172]Kendrick & Walker [173]Poysa [174]Illman [175]Bond [176]ONeil [177]Honeycutt [178]Jellis & Taylor [179]Prochloraz [180]Thiabendazole [181]Captofal [182]Chloramizol sulphate [183]Azoxystrobin [184]Denner [185]Imazalil [186]Gans [187]Brown [188]Harrison & Issac [189]Al-Shukri [190]Catani & Peterson [191]Gudmestad [192]Jellison [193]Mitchell [194]Howard [195]Otazu [196]Bateman [197]Beniwal & Gadauskas [198]Lockwood [199]Mullen [200]Thanassoulopoulos [201]Jones [202]Goodell [203]Burpee & Bloom [204]Gould [205]Morsink [206]Siti [207]Niroshini Gunasinghe [208]Reid [209]Biomass [210]Ergosterol [211]Castillo [212]Pieczarka & Abawi [213]Chen [214]Sitaramaiah & Sinha [215]Bridge & Spooner [216]Bulat & Mironenko [217]Random Amplification of Polymorphic DNA [218]Welsh & McClelland [219]Williams [220]Tommerup [221]Penner [222]Probe [223]Sequenced Characterized Amplified Region [224]Laemlli [225]Ammonium persulphate [226]TEMED (N, N, N, N-tetramethylethylenediamine) [227]Whitford دریافت فایل جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||